產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

G418 Sulfate（G418硫酸鹽），也稱(chēng)作Geneticin（遺傳霉素），是一種結構類(lèi)似于慶大霉素B1（Gentamycin B1）的氨基糖苷類(lèi)抗生素，通過(guò)影響80S核糖體功能和阻斷延伸步驟來(lái)干擾蛋白合成，對原核和真核等細胞都有毒性 ,包括細菌、酵母、高等植物和哺乳動(dòng)物細胞 ,也包括原生動(dòng)物和蠕蟲(chóng)。其抗性基因（主要為neo基因）位于轉座子Tn601（903）或Tn5（來(lái)源于細菌），但是可以在真核細胞中表達。通過(guò)基因重組技術(shù)將這些抗性基因導入細胞，使其獲得對G418的耐藥性，從而用來(lái)篩選和維持培養攜帶抗性基因的原核或者真核細胞。

哺乳動(dòng)物細胞中，當抗性基因neo被整合進(jìn)真核細胞基因組后 ,使其編碼表達氨基糖苷磷酸轉移酶（amino-glycoside 3’-phosphotransferase，APH(3)II）。此酶通過(guò)共價(jià)修飾G418的氨基或羥基功能，抑制抗生素-核糖體間的相互作用，從而使得抗生素失活。這一特性賦予細胞產(chǎn)生抗性。穩轉細胞株篩選實(shí)驗，需要建立殺滅曲線(xiàn)（劑量反應曲線(xiàn)）確定殺死無(wú)抗性細胞的最低有效濃度。

植物細胞中，通過(guò)轉染攜帶nptII基因的抗性質(zhì)粒孵育其抗性。nptII基因也能編碼表達氨基糖苷磷酸轉移酶，這個(gè)酶使得多種抗生素喪失活性，包括G418，卡那霉素和巴龍霉素。

產(chǎn)品性質(zhì)

運輸與保存方法

常溫運輸。-20℃避光保存，有效期3年。避免受潮，否則會(huì )降低抗生素活力。

使用方法

1. G418儲存液的配制（50 mg/mL，活性濃度）

1）活力單位的換算

根據此公式進(jìn)行換算：（1000/A₀）×A₁=A₂，其中A₀是G418的活力值（Potency），因批次而異?？梢?jiàn)批次對應的質(zhì)檢報告，或者瓶子上的標簽。A₁是想配制的活性G418濃度。A₂是實(shí)際稱(chēng)重的粉末與體積比濃度。

比如若所用批次的G418 活力值為：750 μg/mg，要配制50 mg/mL的G418活性濃度，則實(shí)際要配制的粉末濃度為1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。

如果配制10 mL的G418儲存液（活性濃度，50 mg/mL），則需要稱(chēng)取663.3 mg粉末。

2）除菌和保存

根據上述換算得到的實(shí)際粉末稱(chēng)重量，加入10 mL無(wú)菌去離子水內使其完全溶解。

先用5 mL無(wú)菌去離子水預濕潤0.22 μm針頭式過(guò)濾器，除盡水。之后使用此濾器過(guò)濾，除菌后分裝成單次使用的小量（如1mL）放到-20℃凍存，1年穩定。

【注】：①不要對混濁的溶液進(jìn)行過(guò)濾，因為混濁的溶液意味著(zhù)未完全溶解，過(guò)濾過(guò)程中會(huì )造成藥物損失，降低終液的活性。②不建議使用液體培養基，NaCl,磷酸鹽溶液或者有機溶劑來(lái)制備儲存液。

2. 常用篩選濃度

一般來(lái)說(shuō)，剛開(kāi)始篩選轉化子需要高濃度的G418，并用一個(gè)較低濃度的G418用于維持培養。生長(cháng)條件，細胞類(lèi)型和其他的環(huán)境因素都可能影響G418的用量，因此第一次使用的實(shí)驗體系建議通過(guò)殺滅曲線(xiàn)（kill curve），即劑量反應性曲線(xiàn)，來(lái)確定最佳篩選濃度。

通常情況，哺乳動(dòng)物細胞篩選范圍200-2000 μg/mL；植物細胞：10-100 μg/mL；酵母細胞：500-1000 μg/mL；

以下是一些細胞類(lèi)型使用G418篩選使用的濃度，可做參考。

3. 殺滅曲線(xiàn)的建立

【注】：為了篩選得到穩定表達目的蛋白的細胞株，需要確定能夠殺死未轉染宿主細胞的抗生素最低濃度，可通過(guò)建立殺滅曲線(xiàn)（劑量反應曲線(xiàn)）來(lái)實(shí)現，至少選擇6個(gè)濃度。處理分裂期的細胞時(shí)G418的活性最強，因此在添加G418之前需要讓細胞培養一段時(shí)間。

1) 第一天：未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養板上，37℃，CO₂培養過(guò)夜；

【注】：對于需要更高密度來(lái)檢測活力的細胞，可增加接種量。

2) 根據細胞類(lèi)型，設定合適范圍內的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細胞為例，可設定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。

3) 第二天：去除舊的培養基，換用新鮮配制的含有相應濃度藥物的培養基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。

4) 接下來(lái)每3-4天更換新的含藥物培養基。

5) 按照固定的周期（如每2天）進(jìn)行活細胞計數來(lái)確定阻止未轉染細胞生長(cháng)的恰當濃度。選擇在理想的天數（通常是7-10天）內能夠殺死絕大多數細胞的最低濃度為穩定轉染細胞篩選用的工作濃度。

4. 穩定轉染細胞的篩選

1) 轉染48 h后，用含有適當濃度的G418篩選培養基來(lái)傳代細胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。

【注】：細胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷效果最好。則當細胞過(guò)于稠密，其效率會(huì )降低。為了得到較好的篩選效果，最好將細胞稀釋至豐度不超過(guò)25%。

2) 每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養液。

3) 篩選7天后觀(guān)察并評估細胞克?。洌┑男纬汕闆r。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間，這取決于宿主細胞類(lèi)型，轉染，以及篩選效果。

4) 挑取并轉移5-10個(gè)抗性克隆于35 mm細胞培養板，繼續用含藥物的篩選培養液維持培養7天。

5) 之后更換正常培養基培養即可。

注意事項

1) 本品不可高壓滅菌；

2) G418不要和其他的抗生素/抗真菌劑（如青霉素/鏈霉素）共同使用，因為它們是G418的競爭性抑制劑。其他的抗生素也會(huì )產(chǎn)生交叉活性。

3) 配制G418溶液時(shí)，一定要根據G418批次不同的活力值（potency）來(lái)進(jìn)行換算，從而得到需要活性濃度的儲存液以及工作液。

4) G418加入培養體系中未轉染的細胞有可能不會(huì )被殺死，原因在于藥物濃度過(guò)低，或者細胞密度過(guò)高。另外，快速分裂的細胞相對于緩慢增殖細胞，更容易被殺死。對照細胞（未轉染）可能抗生素添加5-7天后才能殺死，轉染細胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。

5) 即使加入殺死劑量的G418，細胞可能會(huì )繼續分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。

6) 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

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