產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

潮霉素B（Hygromycin B）是由吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，通過(guò)干擾70S核糖體易位和誘導對mRNA模板的錯讀而抑制蛋白合成，從而殺死原核（如細菌）、真核（如酵母菌，真菌）和高等哺乳動(dòng)物真核細胞。

大腸桿菌（ Escherichia coli.）來(lái)源的潮霉素抗性基因（hyg或hph），編碼潮霉素B磷酸轉移酶，將潮霉素B轉化成不具有生物活性的磷酸化產(chǎn)物，從而起到解毒作用。針對這一原理，潮霉素B是一種非常有用的選擇性標記，用來(lái)篩選和維持培養成功轉染潮霉素抗性基因的原核或者真核細胞。另外，由于作用模式的差異，常與G418 (Geneticin^TM)，Zeocin? 和Blasticidin S聯(lián)合使用進(jìn)行雙抗性陽(yáng)性細胞株的選擇。潮霉素B還能用作抗病毒劑，因其選擇性滲透進(jìn)入因病毒感染增強通透性的細胞，且具有抑制翻譯的功效。還可混合入動(dòng)物飼料中起到驅蟲(chóng)功能。

本品是無(wú)菌的潮霉素B溶液（50mg/ml in PBS buffer），可直接用培養液稀釋使用。

產(chǎn)品性質(zhì)

使用方法

1.常用篩選濃度

注意：潮霉素B用來(lái)篩選穩轉株的工作濃度需要根據細胞類(lèi)型，培養基，生長(cháng)條件和細胞代謝率而變化，推薦使用濃度為50-1000μg/mL。對于第一次使用的實(shí)驗體系建議通過(guò)建立殺滅曲線(xiàn)（kill curve），即劑量反應性曲線(xiàn)，來(lái)確定最佳篩選濃度。

一般而言，哺乳動(dòng)物細胞50-500μg/mL；細菌/植物細胞20-200μg/mL；真菌300-1000μg/mL。

2. 殺滅曲線(xiàn)的建立

注意：為了篩選得到穩定表達目的蛋白的細胞株，需要確定能夠殺死未轉染宿主細胞的抗生素最低濃度，可通過(guò)建立殺滅曲線(xiàn)（劑量反應曲線(xiàn)）來(lái)實(shí)現，至少選擇5個(gè)濃度。

1）第一天：未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養板上，37℃，CO₂培養過(guò)夜；注：對于需要更高密度來(lái)檢測活力的細胞，可增加接種量。

2）根據細胞類(lèi)型，設定合適范圍內的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細胞為例，可設定50，100，250，500，750，1000μg/mL。先用去離子水或者PBS buffer按照1:10的比例將母液稀釋到5 mg/ml，然后按照下表稀釋到相應濃度的工作液。

3）第二天：替換舊的培養基，換用新鮮配制的含有相應濃度藥物的培養基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。

4）接下來(lái)每3-4天更換新的含藥物培養基。

5）按照固定的周期（如每2天）進(jìn)行活細胞計數來(lái)確定阻止未轉染細胞生長(cháng)的恰當濃度。選擇在理想的天數（通常是7-10天）內能夠殺死絕大多數細胞的最低濃度為穩定轉染細胞篩選用的工作濃度。

3.穩定轉染細胞的篩選

1）轉染48h后，用含有適當濃度的潮霉素B篩選培養基來(lái)傳代細胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。

注意：細胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷效果最好。則當細胞過(guò)于稠密，其效率會(huì )降低。為了得到較好的篩選效果，最好將細胞稀釋至豐度不超過(guò)25%。

2）每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養液。

3）篩選7天后觀(guān)察并評估細胞克?。洌┑男纬汕闆r。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間，這取決于宿主細胞類(lèi)型，轉染，以及篩選效果。

4）挑取并轉移5-10個(gè)抗性克隆于35mm細胞培養板，繼續用含藥物的篩選培養液維持培養7天。

5）之后更換正常培養基培養即可。

注意事項

1）潮霉素B的抗性基因（hyg或hph）除了來(lái)自E. Coli.之外，還發(fā)現于其他的菌株，包括Streptomyces hygroscopicus和Klebsiella pneumoniae。

2） 本品為有毒化合物，避免與皮膚和眼睛接觸，請小心操作。

3） 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

運輸和保存方法

冰袋運輸。4℃保存，2年有效。也可以放在-20℃保存，避免反復凍融。

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