產(chǎn)品介紹：

嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑鏈霉菌（Streptomyces alboniger）發(fā)酵代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，通過(guò)抑制蛋白質(zhì)合成而殺死革蘭氏陽(yáng)性菌，各種動(dòng)物和昆蟲(chóng)細胞。某種特殊情況下有效作用大腸桿菌。作用機制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3′末端的類(lèi)似物，能夠與核糖體的A位點(diǎn)結合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素同A位點(diǎn)結合后，不會(huì )參與隨后的任何反應，從而導致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。

   嘌呤霉素產(chǎn)生菌Streptomyces alboniger內發(fā)現的pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉移酶（PAC），賦予機體對嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性如今普遍應用于篩選特定攜帶pac基因質(zhì)粒的哺乳動(dòng)物穩定轉染細胞株。

嘌呤霉素在細胞穩轉株篩選中的普遍應用與慢病毒載體的特性有關(guān)，現在商業(yè)化的慢病毒載體多數都攜帶pac基因。在某些特定情況下，嘌呤霉素亦可以用來(lái)篩選轉化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。

產(chǎn)品性質(zhì)

CAS號（CAS NO.）    58-58-2

分子式（Formula）     C22H29N7O5·2HCl

分子量（Molecular weight）      544.43 g/mol

純度（Purity, HPLC）  ＞98%

外觀(guān)（Appearance）   白色至米白色粉末

運輸和保存方法

冰袋運輸。-20℃干燥保存，2年有效。

使用方法

1. 建議使用濃度

哺乳動(dòng)物細胞：1-10 μg/mL，最佳濃度需要殺滅曲線(xiàn)來(lái)確定。

大腸桿菌：LB瓊脂培養基篩選穩定轉化pac基因的大腸桿菌，使用濃度為125 μg/mL。

【注】：使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩轉株需要精確的pH值調節，而且受宿主細胞本身的影響。

2. 溶解方法

用蒸餾水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/mL的母液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后分裝于-20℃凍存；也可溶于甲醇，配制成10 mg/mL的儲存液。

3. 嘌呤霉素殺滅曲線(xiàn)的確定（以shRNA轉染或者慢病毒轉導為例）

嘌呤霉素有效篩選濃度跟細胞類(lèi)型、生長(cháng)狀態(tài)、細胞密度、細胞代謝情況及細胞所處細胞周期位置等有關(guān)。為了篩選到穩定表達的shRNA細胞株，確定殺死未轉染/轉導細胞的最低濃度嘌呤霉素至關(guān)重要。建議初次做實(shí)驗的客戶(hù)一定要建立適合自身實(shí)驗體系的殺死曲線(xiàn)（kill curve）。

1）Day 1：24孔板內以5~8×104 cells/孔的密度鋪板，鋪足夠量的孔以進(jìn)行后續的梯度實(shí)驗。37℃細胞孵育過(guò)夜。

2）Day 2：①準備篩選培養基：含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養基（如0-15 μg/mL，至少5個(gè)梯度）；②往孵育過(guò)夜后的細胞內更換新鮮配制的篩選培養基；之后37℃孵育細胞。

3）Day 4：更換新鮮的篩選培養基，并觀(guān)察細胞存活率。

4）根據細胞的生長(cháng)狀態(tài)，約2-3天更換新鮮的篩選培養基。

5）每日監測細胞，觀(guān)察存活細胞率，從而確定抗生素篩選開(kāi)始4-6天內有效殺死非轉染或所有非轉導細胞的藥物最低濃度。

4. 哺乳動(dòng)物穩定轉染細胞株的篩選

等轉染含有pac基因的質(zhì)粒后，細胞在含有嘌呤霉素的培養基中增殖，以篩選出穩定轉染子。

1）細胞轉染48 h后，將細胞（原樣或稀釋?zhuān)┲糜诤羞m當濃度嘌呤霉素的新鮮培養基中培養。

注：當細胞處于分裂活躍期時(shí)，抗生素作用最明顯。細胞過(guò)于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會(huì )明顯下降。最好進(jìn)行細胞分盤(pán)使其密度 不超過(guò)25%。

2）每隔2-3天，移除和更換含有嘌呤霉素的培養基。

3）篩選7天后評估細胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時(shí)間，這依賴(lài)于宿主細胞系和轉染篩選效率。

注：每日進(jìn)行細胞生長(cháng)狀態(tài)的觀(guān)察。嘌呤霉素的篩選至少需要48 h，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天。

4）轉移和放置5-10個(gè)抗性克隆到一個(gè)35 mm的培養皿中，用選擇培養基繼續培養7天。此次富集培養是為日后的細胞毒性實(shí)驗做準備。

注意事項

1）嘌呤霉素為有毒化合物，操作時(shí)請小心拿放。

2）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。