產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)，也稱(chēng)乳酸脫氫酶檢測試劑盒(LDH Assay Kit)或乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒(LDH Release Assay Kit)，是一種基于diaphorase催化的INT顯色反應，通過(guò)比色法檢測細胞毒性時(shí)釋放的乳酸脫氫酶活性或檢測其它樣品中的乳酸脫氫酶活性的試劑盒。
  本試劑盒可以用于常規的乳酸脫氫酶活性的檢測，更常用于以L(fǎng)DH釋放為指標的細胞毒性檢測。同時(shí)，基于細胞總乳酸脫氫酶活性的檢測，本試劑盒也可以用于檢測細胞增殖和細胞毒性檢測。
細胞凋亡或壞死而造成的細胞膜結構的破壞會(huì )導致細胞漿內的酶釋放到培養液里，其中包括酶活性較為穩定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通過(guò)檢測從質(zhì)膜破裂的細胞中釋放到培養液中的LDH的活性，就可以實(shí)現對細胞毒性的定量分析。LDH釋放被看做細胞膜完整性的重要指標，并被廣泛用于細胞毒性檢測。LDH釋放被認為是以前使用放射性的51Cr標記細胞，隨后通過(guò)51Cr釋放進(jìn)行細胞膜完整性檢測的安全有效的替代方法。
  本試劑盒的基本原理是，在乳酸脫氫酶的作用下，NAD+被還原生成NADH，NADH和INT (2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)催化反應生成NAD+和強生色物甲臜(formazan)，在490nm波長(cháng)下產(chǎn)生吸收峰，從而通過(guò)比色來(lái)定量檢測細胞培養液、細胞裂解液等樣品中乳酸脫氫酶的活性。吸光度與乳酸脫氫酶活性成線(xiàn)性正相關(guān)。該酶聯(lián)反應原理的示意圖如下:

試劑盒組份：

注意事項：

1)冷凍會(huì )使樣品中部分乳酸脫氫酶失活，4℃可放置2-3天。建議樣品準備好后盡量當天完成測定。

2)如果檢測細胞培養液中的乳酸脫氫酶，由于血清含有乳酸脫氫酶，建議血清的使用濃度不要超過(guò)1%，并最好使用熱滅活血清。如果一定需要使用10%血清，在檢測時(shí)一定要設置沒(méi)有細胞，但加入了相同體積培養液的對照孔，以用于消除背景。

3)細胞過(guò)度生長(cháng)、密度過(guò)高、離心速度過(guò)大、培養箱內外溫差過(guò)大，都會(huì )造成細胞釋放乳酸脫氫酶增加。

4)如果希望進(jìn)行乳酸脫氫酶活性的絕對定量，用戶(hù)需自備乳酸脫氫酶標準品。

5)本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

6)為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

使用方法：

1. 樣品的準備：

方法一：LDH釋放檢測
1.1)  根據細胞的大小和生長(cháng)速度將適量細胞接種到96孔細胞培養板中，使待檢測時(shí)細胞密度不超過(guò)80-90%滿(mǎn)。
1.2) 吸去培養液，用PBS液洗滌一次。換新鮮培養液(推薦使用含1%血清的低血清培養液或適當的無(wú)血清培養液)，將各培養孔分成如下幾組：包括無(wú)細胞的培養 液孔(背景空白對照孔)，未經(jīng)藥物處理的對照細胞孔(樣品對照孔)，未經(jīng)藥物處理的用于后續裂解的細胞孔(樣品最大酶活性對照孔)，以及藥物處理的細胞 孔(藥物處理樣品孔)，并做好標記。按照實(shí)驗需要給予適當藥物處理(如加入0-10μl左右特定的藥物刺激，可設置不同濃度，不同處理時(shí)間，對照孔中需加 入適當的藥物溶劑對照)，繼續按常規培養。到預定的檢測時(shí)間點(diǎn)前1小時(shí)，從細胞培養箱里取出細胞培養板，在“樣品最大酶活性對照孔”中加入試劑盒提供 的LDH釋放試劑，加入量為原有培養液體積的10%。加入LDH釋放試劑后，反復吹打數次混勻，然后繼續在細胞培養箱中孵育。
1.3) 到達預定時(shí)間后，將細胞培養板用多孔板離心機400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應孔中，隨即進(jìn)行樣品測定。
   方法二：細胞內總LDH的檢測
2.1) 細胞毒性檢測：根據細胞的大小和生長(cháng)速度將適量細胞接種到96孔細胞培養孔板中，使待檢測時(shí)細胞密度不超過(guò)80-90%滿(mǎn)。加入不同藥物進(jìn)行處理，并設 置適當對照。藥物刺激完畢后，將細胞培養板用多孔板離心機400g離心5min。盡量吸除上清，加入150μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10 體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻)，適當搖晃培養板混勻，然后繼續在細胞培養箱中孵育1小時(shí)。隨后將細胞培養板用多孔板離心機400g離心5min。分 別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應孔中，隨即進(jìn)行樣品測定。
2.2) .細胞增殖檢測：根據細胞的大小和生長(cháng)速度將適量細胞接種到96孔細胞培養孔板中，使促進(jìn)細胞增殖的藥物刺激后細胞不超過(guò)80-90%滿(mǎn)為宜。使用不同的 藥物刺激細胞，并設置適當對照。藥物刺激完畢后，將細胞培養板用多孔板離心機400g離心5min。盡量吸除上清，加入150μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供 的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻)，適當搖晃混勻胞，然后繼續在細培養箱中孵育1小時(shí)。隨后將細胞培養板用多孔板離心機400g離 心5min。分別取各孔上清液120μl，加入到一新的96孔板相應孔中，隨即進(jìn)行樣品測定。
注：LDH釋放檢測更加常用一些，細胞內總LDH檢測通?？梢允褂肕TT、WST-1或CCK-8等方法替代。

2. 試劑盒的準備工作：
    1) INT溶液(1X)的配置：根據所需的INT溶液(1X)的量，取適量INT溶液(10X)用INT稀釋液稀釋至1X。例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT稀釋液 ，混勻后即配置為200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜現配現用，配置后4℃保存可于當天使用，不宜配置后凍存。
    2) LDH檢測工作液的配制: 根據待測定的樣品數(含對照)，參考下表在臨檢測前新鮮配制適量的檢測工作液。
注意：LDH檢測工作液必須現配現用，配制和使用過(guò)程中均要注意適當避光。

3) (選做)如果希望進(jìn)行LDH酶活性的絕對定量，需自備LDH標準品，并新鮮配制不同濃度LDH標準品，如10mU/ml、5mU/ml、2.5mU/ml、1.25mU/ml、0.65mU/ml、0 mU/ml。
3. 樣品測定:
    1) 各孔分別加入60μl LDH檢測工作液。
    2) 混勻，室溫(約25℃) 避光孵育30min(可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側擺搖床上緩慢搖動(dòng))。然后在490nm處測定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一 波長(cháng)作為參考波長(cháng)進(jìn)行雙波長(cháng)測定。
    3) 計算(測得的各組吸光度均應減去背景空白對照孔吸光度)
    4) 細胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度－樣品對照孔吸光度) / (細胞最大酶活性的吸光度－樣品對照孔吸光度)×100
    5) 可繪制細胞毒性曲線(xiàn)：縱坐標為實(shí)際吸光度，橫坐標為藥物濃度；據此可計算該藥物作用特定時(shí)間的半致死劑量LD50。

附錄1：
可同時(shí)測定一已知濃度的LDH酶標準品對應的吸光度值，參考以下公式粗略計算出樣品中LDH酶活力：
待測樣品中LDH活力單位(mU/ml)＝
(樣品孔吸光度－背景空白對照孔吸光度) / (標準管吸光度－標準空白管吸光度)×標準品濃度(mU/ml)；
根據計算結果可以比較不同樣品處理組間有無(wú)統計學(xué)差異等。

附錄2：
若需準確計算出LDH酶活性的絕對活性，可通過(guò)一系列LDH標準品及相應測得的吸光度值繪制標準曲線(xiàn)，通過(guò)標準曲線(xiàn)相應公式計算出樣品中LDH的酶活性。 
各孔數值減去空白對照后，以檢測的吸光度(OD490)為縱坐標，LDH酶活力(mU)為橫坐標，繪制LDH標準曲線(xiàn)。同時(shí)計算出該趨勢線(xiàn)的公式。

Fig1. A Typical LDH standard curve

A490nm＝k×LDH酶活力單位(mU)＋b，通過(guò)Excel等軟件計算出趨勢線(xiàn)的斜率k和截距b。
根據上述公式計算樣品中LDH活力。
樣品實(shí)際吸光度(OD490)＝樣品孔測得的吸光度－背景空白對照孔吸光度
檢測體系中LDH酶活力單位(mU)=(OD490-b)/k
樣品中LDH酶活力(mU/ml)＝檢測體系中LDH酶活力單位(mU )/檢測樣品體積

Fig.2 LDH kit is applied to Human Astrocytes(Has) cultured with (Solid bar, Positive control) and without (Open bar, Negative control) Triton X-100

特別提醒：

1) 本公司所有產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員用于生命科學(xué)研究，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅。

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