產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

一種細胞滲透型的dihydro-X-rosamine衍生物，包含標記線(xiàn)粒體的弱巰基反應性的氯甲基官能團。本品是一種還原型的紅色熒光染料（Ex=579 nm，Em=599 nm），本身不發(fā)熒光。只需簡(jiǎn)單孵育細胞，即可被動(dòng)運輸穿過(guò)細胞膜，進(jìn)入細胞后被氧化為發(fā)熒光且具線(xiàn)粒體選擇性的探針，聚集在活性線(xiàn)粒體上。一旦線(xiàn)粒體被染色后，還能根據后續實(shí)驗的需求進(jìn)行固定（醛類(lèi)固定劑如甲醛）和透化（醛類(lèi)去污劑如Triton X-100），探針依然維持在細胞內。本品適合雙標實(shí)驗，因其紅色熒光與其他的綠色熒光探針具有良好的分辨率。

雖然傳統的線(xiàn)粒體熒光探針如TMR和羅丹明123，也能很容易的聚集在功能線(xiàn)粒體上，但是一旦線(xiàn)粒體膜電位喪失即會(huì )被洗掉，從而在一些需要細胞進(jìn)行醛類(lèi)固定或者包含線(xiàn)粒體能量狀態(tài)影響因子的實(shí)驗中，使其應用大受限制。

使用方法

1儲存液的配制

本品是以粉末形式提供，使用前需將本品回溫至室溫。

之后使用細胞培養級別的無(wú)水DMSO將其充分溶解至終濃度1 mM。

本品M. Wt.= 497.08 g/mol，換算下來(lái)，50 μg粉末只需加入100.6 μL DMSO即可得到1 mM儲存液。根據單次的使用量將儲存液分裝后放到-20℃避光，避免反復凍融。特別注意:由于本品是還原型的化合物，對氧氣相當敏感，特別是在溶液中，為了保持產(chǎn)品的穩定性，產(chǎn)品分裝后充氮氣或者氬氣等惰性氣體以防止在凍存的過(guò)程中被氧化。

2工作液的配制

根據不同的實(shí)驗目的使用不同的探針濃度，以下的起始操作條件僅作參考，可根據細胞類(lèi)型和其他的相關(guān)因素如細胞或組織的透化等進(jìn)行適當調整。

用適當的緩沖液或細胞培養基稀釋1 mM儲存液至工作液濃度。一般推薦使用濃度為25-500 nM。對于后續需要做固定或透化的樣本，推薦工作濃度為100-500 nM，為了降低過(guò)度加載導致的潛在偽影和線(xiàn)粒體毒性，在不影響實(shí)驗結果的前提下應盡可能低濃度染色。另外，濃度過(guò)高也可能對其他細胞結構進(jìn)行染色。

注意：1）本品是還原型的熒光探針，使用的工作液濃度比氧化型的濃度一般高3~5倍。以上推薦的濃度是針對氧化型，請使用本品（還原型）時(shí)進(jìn)行適當的濃度調整。2）血清中可能含氧化酶，影響本還原型探針的穩定性。則不建議使用含血清的完全培養基稀釋儲存液。

3染色及檢測

1）壁細胞的染色

培養皿/板內加入適量的培養基覆蓋蓋玻片進(jìn)行爬片培養。當細胞長(cháng)至所需豐度，吸除培養液，加入37℃預熱的染色工作液。在所使用細胞正常培養條件下孵育15-45 min（最佳孵育時(shí)間需優(yōu)化）。染色結束后，使用新鮮培養液或緩沖液替換上述染色液，即可將其置于熒光顯微鏡下觀(guān)察或熒光酶標儀下讀數?；蛘哌M(jìn)行后續的固定和透化步驟，見(jiàn)步驟4。

2）浮細胞的染色

離心收集細胞，吸除上清，利用37℃預熱的染色工作液輕輕重懸細胞。在所使用細胞正常培養條件下孵育15-45 min（最佳孵育時(shí)間需優(yōu)化）。染色結束后，離心收集細胞，利用37℃預熱的新鮮培養液或緩沖液重懸細胞，被染色的細胞可用流式細胞儀、熒光酶標儀、熒光顯微鏡進(jìn)行分析。

如果需要蓋玻片上固定化的細胞，那么可在鋪片前先用多聚賴(lài)氨酸（poly-D-lysine）包被載玻片或蓋玻片?；蛘哌M(jìn)行后續的固定和透化步驟，見(jiàn)步驟4。

4固定和透化

1）色結束后，利用培養液或緩沖液清洗細胞；

2）心吸走清洗液。換用新鮮配制且預熱的含2-4%甲醛的緩沖液或培養液進(jìn)行細胞固定。經(jīng)驗證， 本染料由含3.7%甲醛的完全培養液于37℃孵育內皮細胞15min能起到良好的固定效果。

3）洗細胞：吸除固定液，用適當緩沖液沖洗細胞數次。

4）胞透化（可選）：

像ICC等實(shí)驗需要細胞要做透化，則可將已固定的細胞直接加入含有去污劑如Triton X-100的緩沖液中孵育。透化結束后，用緩沖液清洗細胞即可進(jìn)行后續ICC實(shí)驗。經(jīng)檢測，利用含0.2% Triton X-100的PBS孵育內皮細胞10min可以達到良好的透化效果。

另外，還可利用預冷的丙酮透化5 min，之后用PBS清洗細胞。經(jīng)驗證，即使后繼沒(méi)有進(jìn)一步的抗體標記，丙酮透化處理也可降低背景信號。

注意事項

1）DMSO有毒，使用時(shí)請小心操作。

2）了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

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