產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Calcein, AM，中文名鈣黃綠素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一種具細胞膜滲透性的活細胞熒光染料，呈綠色熒光（Ex/Em= 490nm/515nm）。AM基團的存在不僅加強疏水性，使其能輕易穿透活細胞膜。而且封閉結合鈣離子的分子部分，本身不發(fā)熒光。一旦進(jìn)入細胞后，被細胞內酯酶水解為鈣黃綠素（calcein），能與胞內鈣離子結合，產(chǎn)生強烈的綠色熒光。因不具有細胞膜滲透性，從而被保留在胞內。與其它活細胞染料（如BCECF-AM，CFDA）相比，Calcein, AM最適合用于活細胞染色探針，因細胞毒性很低，而且不會(huì )抑制任何細胞功能如增殖或淋巴細胞趨化性。另外，使用Calcein, AM活性檢測的實(shí)驗結果十分可信，與標準的51Cr釋放法所得結果一致。

由于死細胞缺乏酯酶，Calcein, AM僅對活細胞進(jìn)行標記，這一特征使其非常適合用來(lái)檢測細胞活力和細胞的短期示蹤。常常與碘化丙啶PI聯(lián)合使用，因其僅能穿過(guò)死細胞膜的無(wú)序區域到達細胞核，嵌入細胞的DNA雙螺旋區域，并產(chǎn)生紅色熒光（Ex/Em= 535nm/617nm），僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀(guān)察活細胞和死細胞。用545 nm激發(fā)，僅可觀(guān)察到死細胞。結合這些特點(diǎn)，Calcein, AM和PI經(jīng)常被結合用作活細胞和死細胞的雙重染色。

本試劑盒就是結合Calcein-AM和PI的雙重染料，來(lái)進(jìn)行活細胞和死細胞的雙重染色標記，從而進(jìn)行活細胞和死細胞水平的分析。根據試劑盒優(yōu)化體系，單次以200μl細胞懸液進(jìn)行染色，可做500次檢測。

試劑盒組分

S3512-500T   

S3512-A  Calcein AM Solution(4 mM)   -20oC避光     50μl 

S3512-B  PI Solution（1.5 mM）   -20oC避光     200μl     

S3512-C  10×Assay Buffer     -20oC~4℃     50ml    

保存與運輸方法

保存：-20℃避光保存，有效期一年。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1）由于Calcein-AM對濕度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋子。建議根據單次用量，分裝密封保存。Calcein-AM工作液必須現配現用。

2）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作時(shí)一定要注意防護。若接觸到皮膚，需要立即用自來(lái)水清洗。

3）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、試劑準備

1.1 1×反應緩沖液（Assay Buffer）的配制

從低溫冰箱內取出10×Assay Buffer，根據單次用量無(wú)菌條件取出適量，用去離子水（dH2O）做10倍稀釋以得到1×Assay Buffer。

1.2 1×染色工作液（Stain Buffer）的配制

1） 先將低溫保存的Calcein AM溶液 (4 mM)和PI溶液（1.5 mM）室溫回溫至少20min，使其充分融化?！咀⒁猓旱谝淮问褂脮r(shí)建議對儲存液根據單次用量分裝，特別是Calcein AM，以減少反復凍融次數?！?span>

2） 取5μl Calcein AM溶液 (4 mM)和15μl PI溶液（1.5 mM）加入5ml 1×Assay Buffer，充分混勻。此時(shí)得到Calcein AM的工作液濃度為4μM，PI的工作液濃度為4.5μM。由于不同細胞系的最佳染色條件不同，初次實(shí)驗建議做梯度實(shí)驗，以確定 Calcein-AM和PI的最適濃度。梯度篩選的原則為使用最低的探針濃度得到最好的熒光結果?！咀⒁猓喝旧ぷ饕罕仨毈F配現用，并且在當天用完?！?span>

二、染色步驟

2.1 對于貼壁細胞，先用細胞刮刀或者胰酶-EDTA消化細胞，之后離心收集細胞（1000 rpm，3min）。

對于懸浮細胞，直接離心（1000 rpm，3min）收集細胞。

2.2 去上清，用1×Assay Buffer充分清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

2.3 用1×Assay Buffer制備細胞懸液，使其密度為1×105~1×106細胞/ml。

2.4 取100μl染色工作液加入200μl細胞懸液內，混勻，37℃孵育15min。

【注意：如果需要，可延長(cháng)孵育時(shí)間至30min?！?span>

2.5 熒光顯微鏡下使用490±10 nm激發(fā)濾片同時(shí)檢測活細胞（黃綠色熒光）以及死細胞（紅色熒光）。另外，使用545nm的發(fā)射濾片僅能觀(guān)察到死細胞。也可以直接在熒光酶標儀下使用合適的濾片進(jìn)行檢測。

【注意】：可以使用以下方法來(lái)優(yōu)化得到兩種熒光染料的最佳工作濃度。

a) 用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育細胞10min，或者用70%乙醇孵育細胞30min，從而制備死細胞；

b) 用0.1-10μM的PI溶液進(jìn)行死細胞染色，以得到僅僅對細胞核染色，而不會(huì )對細胞質(zhì)染色的最佳工作濃度。

c) 用0.1-10μM的Calcein AM進(jìn)行死細胞染色，以得到不會(huì )對細胞質(zhì)染色的最佳工作濃度。然后用此濃度進(jìn)行活細胞染色，去觀(guān)察是否活細胞能被染色。

測定方法與結果呈現

1） 熒光顯微鏡（Fluorescent Microscopy）

檢測方法：490±10 nm激發(fā)能同時(shí)看到呈黃-綠色熒光的活細胞和紅色的死細胞。另，545nm激發(fā)可能只能看到呈紅色的死細胞。

Fig 1. Fluorescence microscopy images of calcein-AM (green) and propidium iodide (red). The macrophages differentiated into osteoclasts on (a) nt-TiO2 and (b) nt-TiO2-P for 4 days. Cells were then examined by fluorescence microscopy (Axioplan 2, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) with 490-nm excitation for the simultaneous monitoring of viable and dead cells. [Reference: Tae-Hyung Koo et al. Immobilization of pamidronic acids on the nanotube surface of titanium discs and their interaction with bone cells. Nanoscale Res Lett. 2013; 8(1): 124.]

2） 熒光酶標儀（Fluorescent Plate Reader）

檢測方法：96孔透明底的黑色酶標板（96-well black plate with clear bottom），Calcein檢測的激發(fā)波長(cháng)為490nm，發(fā)射波長(cháng)為520nm；PI檢測的激發(fā)波長(cháng)為530nm，發(fā)射波長(cháng)為617nm；

3） 流式細胞儀（Flow cytometer）

檢測方法：流式細胞儀，Calcein檢測的激發(fā)/發(fā)射波長(cháng)為488/535nm，PI的激發(fā)和發(fā)射波長(cháng)為488/620nm。

Fig 3. Quantification of calcein and PI staining in WT cells and in cells incubated with increasing concentrations of miltefosine: 20μM, 40μM or 100μM for 24h. [Reference: Basmaciyan L et al. Calcein+/PI- as an early apoptotic feature in Leishmania. PLoS One. 2017 Nov 7;12(11):e0187756.]

常見(jiàn)問(wèn)題

1、 該試劑盒適用任何細胞類(lèi)型？

基本上適用于任何含酯酶活性的動(dòng)物細胞。植物和細菌細胞因含有細胞壁，Calcein-AM不能進(jìn)入因此無(wú)法染色。有可能對原生質(zhì)體進(jìn)行染色。

2、 用相同濃度有可能對所有哺乳動(dòng)物細胞進(jìn)行染色？

對所有細胞都用相同的濃度是很不合理的。Calcein-AM和PI的最佳工作濃度根據細胞類(lèi)型差異很大。有必要根據具體細胞來(lái)確定最佳染料濃度。參考說(shuō)明書(shū)染料工作濃度優(yōu)化方法。

3、 Calcein-AM對細胞有毒？

與其他相似的活細胞染料比較，Calcein-AM基本無(wú)毒（毒性最?。?。見(jiàn)文獻EL.S.D.Clerck,et.al., J.Immunol.Methods, 172,115-124(1994)

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