產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結合阻止絲狀肌動(dòng)蛋白（微絲）的解離，穩定微絲結構，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動(dòng)態(tài)平衡。此特性使得肌動(dòng)蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1μg/mL，因此，可用作一種聚合促進(jìn)劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。

本品為鬼筆環(huán)肽-iFluor 405標記探針會(huì )選擇性地結合F-肌動(dòng)蛋白。以納摩爾濃度使用，鬼筆環(huán)肽衍生物是方便的探針，用于標記，鑒定和定量甲醛固定和透化組織切片中的F-肌動(dòng)蛋白，細胞培養物或無(wú)細胞實(shí)驗。肌動(dòng)蛋白是一種球狀的，大約42kDa的蛋白質(zhì)，幾乎存在于所有真核細胞中。 它也是最高度保守的蛋白質(zhì)之一，與藻類(lèi)和人類(lèi)不同的物種相差不超過(guò)20％。 肌動(dòng)蛋白是細胞中兩種細絲的單體亞基：微絲，細胞骨架的三個(gè)主要組分之一，以及微絲，是肌細胞中收縮裝置的一部分。 因此，肌動(dòng)蛋白參與許多重要的細胞過(guò)程，包括肌肉收縮，細胞運動(dòng)，細胞分裂和胞質(zhì)分裂，囊泡和細胞器運動(dòng)，細胞信號傳導，以及細胞連接和細胞形狀的建立和維持。

Warbio生物以1000×儲存液形式（溶于DMSO）提供，按照100μl/孔（96孔板），總共可做300T。

注意事項：   

鬼筆環(huán)肽  的分子量小，很容易通過(guò)細胞，不需要對細胞進(jìn)行冷丙酮和TRITON X-100處理。毒性較大，戴上手套操作。

有幾種方法都能用來(lái)染色組織細胞培養物內的肌動(dòng)蛋白絲（F-actin）染色，其中，固定步驟在獲得可信且具代表性的細胞F-actin分布情況中至關(guān)重要。固定步驟基于實(shí)驗自身需求來(lái)選擇。多聚甲醛或戊二醛都能得到優(yōu)秀的F-actin染色和良好的板狀偽足維持保存。

操作步驟

一、實(shí)驗材料準備

1.1 iFluor 405 Phalloidin（貨號 LX4801）

1.2 1×PBS Buffer（pH 7.4）, for Cell Culture（貨號 SH30256.01）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 （可選）抗熒光淬滅劑

1.6 （可選）即用型PI染色液（貨號 4209）

1.7 （可選）BSA, Standard Grade（貨號 J8660）

1.8 黑框/透明底的96孔細胞培養板

二、染色工作液準備

2.1 于實(shí)驗前將低溫保存的iFluor 405 Phalloidin置于室溫回溫至少20min，低速離心后才開(kāi)瓶。第一次使用請將本品按照單次用量進(jìn)行分裝，置于-20℃避光保存，一年穩定。

2.2 本品以1000×DMSO儲存液形式提供。開(kāi)始實(shí)驗前，使用1×PBS Buffer（pH 7.4）將其稀釋到1×染色工作液（比如1μl儲存液加入1ml PBS Buffer），用槍吹勻即可。

【注①】：以96孔板為檢測體系，按照100μl/孔來(lái)計算，準備足量的染色工作液；也可對細胞爬片進(jìn)行染色，但需調整染色工作液的用量，以能覆蓋住細胞為準。

【注②】：最佳的工作濃度和孵育時(shí)間取決于特定的應用。根據特定的細胞類(lèi)型和/或細胞/組織對探針的通透性來(lái)調整合適的染色條件。

【注③】：可使用含1% BSA的PBS Buffer稀釋儲存液，能夠降低非特異背景染色，也能最小化鬼筆環(huán)肽粘附到管壁的可能性。

【注④】：染色工作液現配現用，室溫避光保存。

三、染色流程（以96孔板為例）

3.1 用黑框/透明底的96孔板進(jìn)行細胞培養，使其貼壁生長(cháng)達到70-80%的匯合度。

3.2 吸掉培養液，用37℃預熱的1×PBS Buffer（pH 7.4）清洗細胞2次。

3.3 用溶于PBS的4%多聚甲醛固定細胞，室溫固定10-30min?！咀⒁狻浚汗潭ㄟ^(guò)程中甲醇能破壞肌動(dòng)蛋白，因此，固定液中最好避免接觸任何甲醇。最好的固定液是無(wú)甲醇的甲醛。

3.4 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.5 用破膜緩沖液透化細胞，室溫處理5min。

3.6 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.7 取100μl現配的iFluor 405 Phalloidin染色工作液到每個(gè)孔內，室溫避光孵育30-90min。

【注意】：若有需要，此時(shí)可加入即用型PI染色液或其他不同于iFluor 405熒光光譜的細胞核染色液。

3.8 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.9 加抗熒光淬滅劑（如Fluoromount-GTM）到孔內保護熒光。

3.10 熒光顯微鏡下觀(guān)察染色結果，選擇iFluor 405激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=400/421nm）。若做細胞核染色，選擇合適濾片，比如PI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=536/617nm）。

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