Fluo-4, AM是Fluo-4的一種乙酰甲酯衍生物，具有細胞膜滲透性，只需簡(jiǎn)單培養，即可輕易進(jìn)入細胞。一旦進(jìn)入細胞內，即被其內酯酶剪切生成不具膜滲透性的Fluo-4，從而滯留在胞內以發(fā)揮相應生理功能。

Fluo-4是可見(jiàn)光激發(fā)波長(cháng)Ca2+熒光探針Fluo-3的改良版本，通過(guò)將Fluo-3結構上的氯離子（Cl-）替換為電子吸引力更強的氟離子（F-），使得最大激發(fā)波長(cháng)往短波長(cháng)偏移10nm左右。正由于這個(gè)波長(cháng)更接近氬激光器的波長(cháng)，則當使用氬激光器來(lái)激發(fā)探針Fluo-4，能夠得到更強的熒光強度，比Fluo-3強一倍。另外，Fluo-4的Ca2+親和力幾乎接近Fluo-3（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM），因此，使用上幾乎同Fluo-3。Ca2+結合后的最大激發(fā)波長(cháng)為494nm，最大發(fā)射波長(cháng)為516nm?？赏ㄟ^(guò)激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀來(lái)檢測胞內鈣離子水平的變化。

可見(jiàn)光激發(fā)Ca2+熒光探針的優(yōu)勢：

與紫外光激發(fā)的熒光探針相比，如Fura-2和Indo-1，可見(jiàn)光激發(fā)Ca2+探針具有以下特點(diǎn)：

1）適用于大多數的激光共聚焦測鈣系統，包括共聚焦激發(fā)掃描顯微鏡以及流式細胞儀等。

2） 具有更強的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca2+變化，從而降低對活細胞的光毒性。

3）Ca2+依賴(lài)性熒光強度增強，對Ca2+變化水平檢測敏感度更高。

4）降低樣品自熒光以及光散射的干擾。

5）兼容光激活探針以及UV-激發(fā)試劑，因此更方便于多參數檢測。

6）無(wú)光譜偏移。

Fluo-4, AM相比較于Fluo-3的優(yōu)勢：

1）激發(fā)和發(fā)射波長(cháng)往短波長(cháng)偏移10nm，更接近氬激光器的波長(cháng)，。因此，當使用488nm進(jìn)行熒光激發(fā)，得到更強的熒光信號，比Fluo-3強一倍。

2）50μg小包裝供應，使用方便，且能很好保證產(chǎn)品的穩定性。

可見(jiàn)光激發(fā)Ca2+熒光探針的優(yōu)勢：

與紫外光激發(fā)的熒光探針相比，如Fura-2和Indo-1，可見(jiàn)光激發(fā)Ca2+探針具有以下特點(diǎn)：

1）適用于大多數的激光共聚焦測鈣系統，包括共聚焦激發(fā)掃描顯微鏡以及流式細胞儀等。

2） 具有更強的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca2+變化，從而降低對活細胞的光毒性。

3）Ca2+依賴(lài)性熒光強度增強，對Ca2+變化水平檢測敏感度更高。

4）降低樣品自熒光以及光散射的干擾。

5）兼容光激活探針以及UV-激發(fā)試劑，因此更方便于多參數檢測。

6）無(wú)光譜偏移。

Fluo-4, AM相比較于Fluo-3的優(yōu)勢：

1）激發(fā)和發(fā)射波長(cháng)往短波長(cháng)偏移10nm，更接近氬激光器的波長(cháng)，。因此，當使用488nm進(jìn)行熒光激發(fā)，得到更強的熒光信號，比Fluo-3強一倍。

2）50μg小包裝供應，使用方便，且能很好保證產(chǎn)品的穩定性。

產(chǎn)品性質(zhì)

CAS 號（CAS NO.）:273221-67-3

分子式（Molecular Fomular）:C51H50F2N2O23

分子量（Molecular Weight）：1096.95

Ex/Em (nm)：494nm/516nm

純度（Purity）：≥98%

外觀(guān)（Appearance）:粉末

使用說(shuō)明：

1. （可選）配制Pluronic F-127母液：100mg Pluronic F-127粉末中加入0.5ml DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解過(guò)程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不要冷藏。如果有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2. Hanks balanced salt solution（HBSS,不含Ca2+, Mg2+）

操作方法

1）Fluo-4,AM母液的配制：向 Fluo-4, AM中加入適量DMSO，配制成1-5mM的儲存液，DMSO的加入量根據Fluo-4,AM（MW1096.95）分子量進(jìn)行計算（如：若配制成1mM的母液，需向50ug Fluo-4,AM中加入45.6ul DMSO）。

【注】：溶解用的DMSO需要保證新鮮無(wú)水，否則將會(huì )導致 AM 體水解，使熒光染料無(wú)法進(jìn)入細胞，影響實(shí)驗效果。

2）Fluo-4,AM工作液的配制：利用HBSS將Fluo-4,AM稀釋成1-5μM的工作液，具體稀釋方法如1 mM母液配制1 ml濃度為4 μM工作液，用1 ml HBSS溶液稀釋4 μl 1mM母液即可。

【注】：① 推薦該探針加載濃度在4-5μM，具體的使用濃度需根據實(shí)驗要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過(guò)度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結果的基礎上盡量使用最低探針濃度。

② Fluo-4,AM工作液需現配現用，避免反復凍存。

3）（可選）如果Fluo-4進(jìn)入細胞的效果不好，可向 Fluo-4, AM/DMSO 溶液中加入適量20% Pluronic F127溶液，最終稀釋至其終濃度為0.04-0.05%，Pluronic F127 可以防止 Fluo-4, AM 在 HBSS中聚合并能幫助其進(jìn)入細胞。

【注】：Pluronic F127可降低Fluo-4,AM的穩定性，因此只建議在配制工作液時(shí)加入，不建議將其加入儲存液長(cháng)期保存。

4）取出預培養的細胞，除去培養基，使用 HBSS 溶液洗滌細胞 3次。

【注】：如果使用含血清的培養基，血清中的酯酶會(huì )分解 AM 體，從而降低 Fluo 4-AM 進(jìn)入細胞的效果。另外含有酚紅的培養基會(huì )使本底值略微偏高，所以加工作液之前需盡量去除培養基殘留。

5）將 Fluo-4, AM工作液加入細胞，加入量以覆蓋細胞為準。在37℃培養10-60min，然后除去 Fluo 4-AM 工作液。

【注】：關(guān)于孵育的時(shí)間，如果首次做實(shí)驗不能確定，建議先孵育30分鐘，看熒光效果：如果細胞死亡較多，適當縮短時(shí)間；如果熒光強度太弱，適當延長(cháng)時(shí)間。

6）用HBSS溶液洗滌細胞 3 次，以充分去除殘留的 Fluo 4-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆蓋細胞。

7）37℃培養箱孵育約 20-30 分鐘，以確保 AM 體在細胞內的完全去酯化作用。

8）用激光共聚焦或熒光顯微鏡檢測細胞，激發(fā)波長(cháng) 494 nm，發(fā)射波長(cháng) 516 nm。

Fluo-4- AM  cell permeant

注意事項

1）熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2）本Fluo-4,AM 容易吸潮，從冰箱取出后，請確認在干燥的環(huán)境放至室溫后再開(kāi)封。由于試劑極其微量，開(kāi)封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3）第一次使用時(shí)，建議母液即配即用。試劑溶解后盡可能在短時(shí)間內使用，以保證實(shí)驗效果。

4）母液遇水極易分解，如果不能一次用完，建議分裝保存，例如分裝成5μl/管，用封口膜封口，并用鋁箔紙包裹，放在一個(gè)密閉性能好的塑料袋中，并放入一包干燥劑，在≤-20℃密封避光保存。

5）建議您在正式實(shí)驗前先摸索一下細胞量、鈣離子熒光探針的終濃度、培養時(shí)間等，找到最佳實(shí)驗條件。

6）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

7）保存條件：-20℃

產(chǎn)品相關(guān)：