產(chǎn)品描述

        Single Cell Squence Specific Amplification Kit是基于一步RT-PCR的預擴增方法，適用于單細胞或者微量總RNA中轉錄組的擴增，便于進(jìn)行單細胞轉錄組表達差異的分析。本試劑盒實(shí)現了RNA提取純化、逆轉錄和PCR預擴增反應在同一管內完成，不需要額外的操作，簡(jiǎn)單高效，還能減少實(shí)驗誤差和污染風(fēng)險。除了應用于單細胞，本試劑盒亦可適用于2~1,000個(gè)細胞的一步擴增，應用時(shí)僅需按照細胞數目減少一步擴增的循環(huán)數；獲得的擴增產(chǎn)物適合于任何實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析法。染料法和探針?lè )╭PCR分別推薦ToloBio通用型2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal, #22204)和2 × Q3 probe qPCR Master Mix (Universal, #22205)。

 產(chǎn)品優(yōu)勢

? 一步法RT-PCR預擴增：細胞裂解、RNA逆轉錄和PCR擴增在同一管內完成，不需要額外的移管操作。
? 一次可擴增500個(gè)靶基因：擴增產(chǎn)物適合用任何實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀分析。

 實(shí)驗案例

        分別使用ToloBio #22121與競品Supplier A、Supplier B，對不同濃度的小鼠巨噬細胞進(jìn)行一步法RT-PCR預擴增，產(chǎn)物進(jìn)一步qRCR（ToloBio #22204）擴增，比較在相同引物和相同細胞個(gè)數條件下的擴增情況，包括擴增靈敏度、擴增線(xiàn)性和擴增平臺。結果顯示，ToloBio #22121在不同濃度細胞（1～1000個(gè)細胞/test）條件下擴增性能穩定、優(yōu)異。

 實(shí)驗流程

1.Primer Pool的制備
        將不同待測基因的擴增引物進(jìn)行混合，制備成Primer Pool，使各引物的終濃度為0.1 μM。以Bcl-2基因為例，其上、下游引物原濃度均為100 μM，則應各取1 μL加入998 μL RNase-free ddH2O至終體積為1 mL。多個(gè)基因引物對的制備依此類(lèi)推，最多可混合500對不同基因的擴增引物。

2.預擴增反應體系
        在RNase-free離心管中冰上配制如下反應體系：

a.細胞可儲存于PBS緩沖液中。
以上體系（除細胞樣本外）充分混勻后冰上放置備用，可加入1~1000個(gè)細胞樣本。為了使細胞充分破碎，將加入細胞樣本的完整體系置于-80℃冰箱2 min，隨后3,000 rpm (1,000 × g)室溫或4℃離心2 min，然后立即放入PCR儀進(jìn)行如下反應：

b.建議循環(huán)數隨起始細胞數量作相應調整：1個(gè)細胞20個(gè)循環(huán)，10個(gè)細胞17個(gè)循環(huán)，100個(gè)細胞14個(gè)循環(huán)，1,000個(gè)細胞11個(gè)循環(huán)。 
反應結束后，每管加入20 μL RNase-free ddH2O (1:5稀釋)，用移液器吹打混勻，室溫短離集于管底?？闪⒓催M(jìn)行后續qPCR定量反應或-20℃短期保存。

3.qPCR反應體系
冰上配制如下反應體系：

c.為減少加樣誤差，建議將1:5稀釋的預擴增產(chǎn)物再稀釋10倍后使用。

以上體系充分混勻后，短暫離心集于管底，隨后立即放入qPCR儀進(jìn)行如下反應：

 產(chǎn)品組成

d.包含 dNTP；
e.包含RTase、RNase inhibitor和Taq DNA polymerase；

保存條件

-20℃保存，≤ 0℃運輸；