產(chǎn)品描述

Cas12a High Yield crRNA Synthesis and Purification Kit 是基于 T7 RNA 聚合酶的體外 RNA 轉錄試劑盒，可高效進(jìn)行 Cas12a crRNA 的制備。使用本試劑盒時(shí)，僅需按照本試劑盒說(shuō)明書(shū)設計并合成 Target AntisenseOligo，每次反應可獲得 50-150 μg 的 Cas12a crRNA。獲得的 Cas12a crRNA 可應用于 CRISPR 分子診斷、基因編輯等。

產(chǎn)品組分

a. Cas12a Control Target Antisense Oligo 是陽(yáng)性對照，可與 Cas12a Sense Oligo 退火后，作為轉錄模板使用，用來(lái)測試體外轉錄體系的反應效率。在 37℃孵育 30 min 條件下，對照轉錄反應體系生成的 crRNA 產(chǎn)量≥50 μg，其產(chǎn)量在純化后由NanoDrop 測定。在變性條件下進(jìn)行 TBE-Urea gel 電泳，可觀(guān)察到 crRNA 單條帶大小約為 40 nt。

b. 本產(chǎn)品中 Part B 組分（純化磁珠，#3620F）與 Part A 組分保存條件不同，因此 Part B 組分需單獨運輸！

保存條件

Part A 組分-20℃保存，有效期 1 年。

需自備的實(shí)驗物品

PCR 儀

無(wú)水乙醇

異丙醇

無(wú)核酸酶水

96 孔磁力架

96 孔板或 PCR 8 聯(lián)排管

移液器及吸頭

Cas12a crRNA 轉錄引物設計

1.Cas12a crRNA 轉錄原理示意圖

Cas12a crRNA 轉錄原理示意圖如圖 1 所示，試劑盒中已提供 Cas12a Sense Oligo，只需根據待測目標序列設計 Target Antisense Oligo。

圖 1. Cas12a crRNA 轉錄原理示意圖

2.Target Antisense Oligo 設計舉例

2.1 選取 20 bp 的 Target Sequence，其中方框部分為 PAM 序列，下劃線(xiàn)部分為 Target Sequence。

2.2 根據選取的 Target Sequence 設計 Target Antisense Oligo，則其序列應為：

其中灰色部分表示 T7 Promoter 反向互補序列，波浪線(xiàn)部分為 Cas12a DR 反向互補序列，兩者均為固定序列。下劃線(xiàn)部分為 Target Sequence。

2.3 轉錄得到的 Cas12a crRNA 序列應為：

波浪線(xiàn)部分為 LbCas12a DR 序列，下劃線(xiàn)部分為 Target Sequence 反向互補序列。

實(shí)驗流程

1.DNA 轉錄模板制備

1.1 退火體系配制

1.2 PCR 退火程序設置

2.Cas12a crRNA 體外轉錄

2.1 按下表試劑的順序進(jìn)行體外轉錄反應體系的配制：

· 請將試劑解凍并完全混勻后再使用。

· 5 × TranscriptMax Reaction Buffer 中含有亞精胺，而亞精胺與核酸容易形成復合體沉淀，DNA 轉錄模板盡量最后加入到體系中。

· 上述反應體系的總體積為 20 μL，可適當等比例調整反應體系。

2.2 將上述試劑充分混勻，然后短暫離心，在 37℃下孵育 0.5-1 h 進(jìn)行體外轉錄。

2.3 37℃孵育結束后，按照下表配制 30 μL 的 DNase Ⅰ反應液加入到 20 μL 的體外轉錄產(chǎn)物中，以去除轉錄體系中的 DNA 模板。

DNase Ⅰ反應條件：37℃，30 min。

3.Cas12a crRNA 轉錄產(chǎn)物磁珠純化

3.1 首先將磁珠從 4℃冰箱中取出，在室溫中放置約 30 min，使其溫度平衡至室溫。顛倒或渦旋振蕩使磁珠充分混勻，吸取 25 μL 磁珠和 50 μL 異丙醇加入到 50 μL 待純化的 crRNA 樣品中，用移液器吹打充分混勻。

3.2 室溫孵育 5 min，使 RNA 結合到磁珠上。

3.3 將樣品置于磁力架上 5 min，待溶液澄清后，小心移除上清。

3.4 保持樣品置于磁力架上，加入 200 μL 新鮮配制的 80%乙醇，漂洗磁珠，室溫孵育 30 s，小心移除上清。

注：漂洗時(shí)使用的 80% (v/v)乙醇需要使用 Nuclease-free water 新鮮配制，配制方法舉例如下：分別量取8 mL 無(wú)水乙醇和 2 mL Nuclease-free water，混勻后可得 10 mL 80% (v/v)乙醇。

3.5 重復步驟 4，共漂洗 2 次。

3.6 保持樣品始終處于磁力架上，開(kāi)蓋空氣干燥磁珠 5 min。

注：磁珠開(kāi)蓋晾干時(shí)要避免過(guò)分干燥，如果磁珠出現龜裂，則提示磁珠過(guò)分干燥，此時(shí) RNA 的洗脫效率會(huì )降低。

3.7 將樣品從磁力架上取出，加入 50 μL Nuclease-free water，用移液器吹打以充分混勻，室溫靜置 5 min。

3.8 將樣品置于磁力架 5 min，待溶液澄清后，小心轉移上清至一個(gè)新的 Nuclease-free PCR 管中，即得到純化后的 Cas12a crRNA。

注意事項

1. 本試劑盒制備的 crRNA 為目前最常用的 LbCas12a crRNA，如果要制備其它類(lèi)型的 Cas12a crRNA 只需在設計 Target Antisense Oligo 時(shí)，將 DR 序列修改為相應類(lèi)型的 Cas12a DR 序列即可。

2. 本試劑盒的 Part B 組分（純化磁珠，#3620F）單獨運輸。磁珠保存條件為 2-8℃，嚴禁凍存和高速離心操作。

3. 由于 DNaseⅠ對不同 DNA 序列的消化能力存在差異，如果純化完成后仍然存在殘留模板 DNA，可以再次進(jìn)行 DNaseⅠ處理，然后再次純化。

4. 轉錄模板的純度會(huì )顯著(zhù)影響體外轉錄反應。例如模板 DNA 中混入 RNase、EDTA、NaCl 等高鹽溶液均可顯著(zhù)抑制體外轉錄反應，導致 RNA 合成量減少。

5. 實(shí)驗過(guò)程應選用無(wú)核酸酶的槍頭和離心管。