產(chǎn)品描述

TranscriptMax T7 High Yield RNA Synthesis Kit 是基于 T7 RNA 聚合酶的高效 RNA 體外轉錄試劑盒。該試劑盒中含有 T7 RNA 聚合酶、反應緩沖液、核苷酸混合液等經(jīng)過(guò)優(yōu)化的試劑，可以將含有 T7 啟動(dòng)子的 DNA 模板高效轉錄成 RNA。本試劑盒可應用于制備 guide RNA、RNA 標準品等。

產(chǎn)品組分

a. Positive Control Template 是陽(yáng)性對照，可作為轉錄模板使用，用來(lái)測試體外轉錄體系的反應效率。在 37℃孵育30 min 條件下，對照轉錄反應體系生成的轉錄 RNA 產(chǎn)量≥50 μg，其產(chǎn)量在純化后由 NanoDrop 測定。

保存條件

-20℃保存，有效期 1 年。

實(shí)驗流程

1.T7 RNA 轉錄原理示意圖

T7 RNA 轉錄原理示意圖如圖 1 所示。

2.DNA 轉錄模板類(lèi)型

2.1 質(zhì)粒模板

帶有 T7 啟動(dòng)子的質(zhì)?？梢宰鳛檗D錄模板，但是質(zhì)粒必須要線(xiàn)性化，可通過(guò)限制性核酸內切酶或 PCR 擴增的方法將質(zhì)粒線(xiàn)性化。質(zhì)粒線(xiàn)性化后，將純化后的產(chǎn)物作為模板，每個(gè)反應體系建議加入 1 μg 的線(xiàn)性化質(zhì)粒作為模板進(jìn)行體外轉錄。

2.2 PCR 產(chǎn)物模板

帶有 T7 啟動(dòng)子的 PCR 產(chǎn)物可以作為轉錄模板。需要通過(guò)電泳確定 PCR 產(chǎn)物的特異性和濃度，一般在 20 μL 的體外轉錄體系中加入 2-5 μL 的 PCR 產(chǎn)物作為模板。

2.3 合成的DNA模板

帶有 T7 啟動(dòng)子的合成 DNA 片段可以作為轉錄模板。一般將合成的 T7 oligo 和 T7 oligo 反向互補的模板鏈退火后作為模板，每個(gè)反應體系建議加入 0.25 μM-1 μM 的退火產(chǎn)物作為模板。

3.體外轉錄反應

3.1 按下表試劑的順序進(jìn)行反應體系的配制。

· 請將試劑解凍并完全混勻后再使用。
· 5 × TranscriptMax Reaction Buffer 中含有亞精胺，而亞精胺與核酸容易形成復合體沉淀，DNA 轉錄模板盡量最后加入到體系中。
· 上述反應體系的總體積為 20 μL，可適當等比例調整反應體系。

3.2 將上述試劑充分混勻，然后短暫離心，在 37℃下孵育 0.5-1 h 進(jìn)行體外轉錄。

3.3 37℃孵育結束后，后續進(jìn)行轉錄產(chǎn)物的純化推薦使用 Tolo RNAclean Kit (#36201) ，該試劑盒具有徹底去除 DNA 模板殘留，操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。

注意事項

1. 使用質(zhì)粒作為轉錄模板的時(shí)候，質(zhì)粒必須要進(jìn)行線(xiàn)性化處理，否則轉錄的產(chǎn)物會(huì )出現長(cháng)度大小不一的情況。

2. 轉錄模板的純度會(huì )顯著(zhù)影響體外轉錄反應。例如模板 DNA 中混入 RNase、EDTA、NaCl 等高鹽溶液均可顯著(zhù)抑制體外轉錄反應，導致 RNA 合成量減少。

3. 實(shí)驗過(guò)程應選用無(wú)核酸酶的槍頭和離心管。