正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養細胞中，催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成H2O2和O2。SOD不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系統中具有重要作用。

測定原理：

通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產(chǎn)生超氧陰離子(O^2-.)，O^2-.可還原氮藍四唑生成藍色甲臜，后者在560nm處有吸收；SOD可清除O^2-.，從而抑制了甲臜的形成；反應液藍色越深，說(shuō)明SOD活性愈低，反之活性越高。

組成：

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1ml玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水

粗酶液提?。?/span>

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計預熱30min以上，調節波長(cháng)至560nm，蒸餾水調零。

2、 將試劑二用蒸餾水稀釋兩倍，用多少配多少。（試劑二和蒸餾水1：1稀釋?zhuān)?/span>

3、 將一瓶試劑四用5ml蒸餾水溶解（溶解后一周內用完），再用蒸餾水稀釋4倍，用多少配多少（試劑四和蒸餾水1：3稀釋?zhuān)?/span>

4、 測定前將試劑一、三和四在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其他物種）水浴5min以上。

5、 樣本測定（在EP管中依次加入下列試劑）：

充分混勻，室溫靜置30min后，加入1ml玻璃比色皿，560nm處測定各管吸光值A。

注意事項：

1、試劑二為酶，不可冷凍，使用時(shí)在冰上放置。

2、對照管只需要做一管。

3、若對照管吸光值大于2，建議將試劑二用蒸餾水稀釋7倍后使用（10μl試劑二原液+60μl蒸餾水）。

4、SOD為什么有的樣本測定管大于對照管，對照管數值在什么范圍？

對照管的范圍是0.8-2。對照管吸光值過(guò)低可能是（1）試劑二或試劑四沒(méi)有現配現用；（2)沒(méi)有按順序加試劑；（3）反應時(shí)間不夠，可以延長(cháng)反應時(shí)間（反應時(shí)間30min可以延長(cháng)到40min）。對照管吸光值過(guò)高可能是試劑二未按操作說(shuō)明書(shū)稀釋相應倍數。

若出現測定管大于對照管，可能是樣本中雜質(zhì)的影響太大，為了降低雜質(zhì)的影響一般將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋10倍后再測，通?？梢允箿y定正常。計算公式中乘以相應稀釋倍數。

SOD活性計算：

1、抑制百分率的計算

抑制百分率＝(A對照管－A測定管) ÷A對照管× 100%

盡量使樣本的抑制百分率在10-90%范圍內。如果計算出來(lái)的抑制百分率小于10%或大于90%，則通常需要調整加樣量后重新測定。如果測定出來(lái)的抑制百分率偏高，則需將樣本用提取液適當稀釋?zhuān)蝗绻麥y定出來(lái)的抑制百分率偏低，則需重新準備濃度比較高的待測樣本。

2、SOD酶活性單位：在上述黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應體系中抑制百分率為50%時(shí)，反應體系中的SOD酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(U/ml)。

3、SOD酶活性計算：

（1）血清（漿）SOD活性(U/ml)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V反總]÷V樣

=11.4×抑制百分率÷(1－抑制百分率)

（2）組織、細菌或培養細胞SOD活力計算：

a.按樣本蛋白濃度計算

SOD活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V反總]÷(V樣×Cpr)

 =11.4×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

b.按樣本鮮重計算

SOD活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)

 =11.4×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷W

c.按細菌或細胞個(gè)數計算

SOD活力(U/10⁴ cell)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率) ×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)

 =0.0228×抑制百分率÷(1－抑制百分率)

 V反總：反應體系總體積，1.026ml；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.09ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml ；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wàn)。