正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養細胞中，可催化過(guò)氧化氫氧化酚類(lèi)和胺類(lèi)化合物，具有消除過(guò)氧化氫和酚類(lèi)、胺類(lèi)毒性的雙重作用。

測定原理：

POD催化H₂O₂氧化特定底物，在470nm有特征光吸收。

組成：

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1 ml玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟和加樣表：

1、 分光光度計預熱30min以上，調節波長(cháng)至470nm，蒸餾水調零。

2、 工作液的配制：臨用前將試劑一、試劑二、試劑三按照2.6（ml）：1.5（μl）：1（μl）的比例混勻；在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）預熱10min以上；現配現用。

3、 在1ml玻璃比色皿中加入50μl樣本和950μl工作液，混勻，記錄470nm下1min時(shí)吸光值A1和2min后的吸光值A2。計算ΔA＝A2-A1。

注意：

如果ΔA小于0.005，可將反應時(shí)間延長(cháng)到5min。如果ΔA大于0.5，可將樣本用提取液稀釋后測定，計算公式中乘以相應稀釋倍數。

POD活性計算：

1、血清（漿）POD活性

單位定義：每ml血清（漿）在每ml反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

計算公式：

POD（U/ml）=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T =2000×ΔA

2、組織、細菌或細胞POD活性

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白在每ml反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/mg prot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =2000×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織在每ml反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =2000×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞在每ml反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =4×ΔA

V反總：反應體系總體積，1ml； V樣：加入樣本體積，0.05ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。