正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

GOD（EC 1.1.3.4）廣泛存在于動(dòng)物、和植物中，催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并產(chǎn)生H₂O₂，是生物體中產(chǎn)生活性氧的代謝途徑之一

測定原理：

GOD催化產(chǎn)生H₂O₂，過(guò)氧化物酶催化H₂O₂氧化4-氨基安替比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在500 nm有特征吸收峰，顏色深淺與GOD活性成線(xiàn)性關(guān)系。

試劑的組成和配制：

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入20ml緩沖液充分溶解待用；用不完的試劑4℃保存一個(gè)月；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入20ml緩沖液充分溶解待用；用不完的試劑4℃保存一個(gè)月。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 ml玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水。

樣品測定的準備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至500nm，蒸餾水調零。

2、 試劑一和試劑二的配制：參見(jiàn)試劑的組成和配制。

3、煮沸樣本的準備：取500μl樣本至新的EP管中，95℃水浴10min，冷卻至室溫后，8000g 4℃離心10min，取上清作為對照管的煮沸樣本待測。

4、測定操作表

混勻，35'C保溫15min后，于500nm波長(cháng)處讀取吸光度。ΔA=A測定管-A對照管。每個(gè)測定管需設一個(gè)對照管。

GOD活力單位的計算：

1、標準條件下測定回歸方程為y = 2.8348x - 0.0169；x為H₂O₂標準品濃度（μmol/ml），y為ΔA。

1、血清（漿）GOD活力的計算

單位定義：每ml血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂為一個(gè)酶活力單位。

GOD（nmol/min/ml）= (ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反總÷V樣÷T×1000=58.8×(ΔA+0.0169)

2、細菌、細胞或組織GOD活力的計算

（1）按蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂為一個(gè)酶活力單位。

GOD（nmol/min/mg prot）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反總÷(V樣×Cpr) ×1000÷T

=58.8×(ΔA+0.0169)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂為一個(gè)酶活力單位。

GOD（nmol/min/g鮮重）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ×1000÷T

=58.8×(ΔA+0.0169)÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義：每一萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H₂O₂為一個(gè)酶活力單位。

GOD（nmol/min/10⁴ cell）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ×1000÷T

=0.118×(ΔA+0.0169)

V反總：反應體系總體積，0.625ml； V樣：加入樣本體積，0.25ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，15 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。

(3)按細菌或細胞密度計算

NADPH (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.003× (△A -0.0259）

V1：加入反應體系中樣本體積，0.05ml；V2：加入提取液體積，2ml；V3：加入血清（漿）體積：0.1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wàn)。