正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

單寧酶全稱(chēng)是單寧酯酰水解酶(Tannase，EC 3.1.1.20)，它可以水解沒(méi)食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒(méi)食子酸和葡萄糖

測定原理：

使用抗氧化劑沒(méi)食子酸丙酯（PG）作為單寧酶酶促反應的底物，在270nn下測定底物PG反應前后的光密度變化，計算單寧酶酶活力。

試劑的組成和配制：

試劑二：粉劑×1支，4℃保存；臨用前每支加入6ml試劑一，充分溶解后備用；用不完的試劑4℃保存。

需自備的的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽、冰、蒸餾水

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

液體樣本：直接取上清測定。

測定步驟：

1、分光光度計預熱30min以上，調節波長(cháng)至270nm，蒸餾水調零。

2、加樣表：

混勻，40℃準確保溫10 min后，置95℃水浴中10 min（蓋緊，防止水分散失），冷卻，

混勻，取200uL至微量石英比色皿或96孔UV板中，270nm處讀取各管吸光值。計算ΔA=A對照-A測定。每個(gè)測定管需設個(gè)一個(gè)對照管。

注意事項：

1、可以在不同對照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集中進(jìn)行5min 95℃沸水浴處理。

2、務(wù)必使用96孔UV板（非普通酶標板，普通酶標板只能透過(guò)可見(jiàn)光，不能透過(guò)紫外光，檢測波長(cháng)小于340nm務(wù)必使用UV板）。

TAN活力單位的計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準條件下測定回歸方程為y = 0.0058x + 0.0044，R2 = 0.9994；x為PG含量（μmol/L），y為吸光值。

1、按樣本體積計算

單位的定義：40℃下每毫升粗酶液每分鐘水解減少0.01μmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位。

TAN活性(μmol/min/ml)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷V樣÷T

=34.48×( ΔA-0.0044）

2、按照蛋白濃度計算

單位的定義：40℃下每毫克蛋白每分鐘水解減少0.01μmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

TAN活性((μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷(V樣×Cpr)÷T

=34.48×(ΔA-0.0044）÷Cpr

3、按照樣本鮮重計算

單位的定義：40℃下每克樣品每分鐘水解減少0.01μmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

TAN活性(μmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=34.48×(ΔA-0.0044）÷W

V反總：反應體系總體積，1ml； V樣：加入樣本體積，0.05ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，10min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。

b.用96孔板測定的計算公式如下

標準條件下測定回歸方程為y = 0.0029x + 0.0044，R2 = 0.9994；x為PG含量（μmol/L），y為吸光值。

1、按樣本體積計算

單位的定義：40℃下每毫升粗酶液每分鐘水解減少0.01μmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

TAN活性(μmol/min/ml)=(ΔA-0.0044）÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷V樣÷T

=68.97×( ΔA-0.0044）

2、按照蛋白濃度計算

單位的定義：40℃下每毫克蛋白每分鐘水解減少1μmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

TAN活性(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044）÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷(V樣×Cpr)÷T

=68.97×( ΔA-0.0044）÷Cpr

3、按照樣本鮮重計算

單位的定義：40℃下每克樣品每分鐘水解減少0.01μmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

TAN活性(μmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0044）÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=68.97×( ΔA-0.0044）÷W

V反總：反應體系總體積，1ml； V樣：加入樣本體積，0.05ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，10min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。