正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養細胞中，NAD⁺是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要氫受體，生成的NADH經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成ATP的同時(shí)，形成大量的ROS，同時(shí)NADH再生為NAD⁺。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應絕大部分通過(guò)這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD⁺比值的高低可用于評價(jià)糖酵解和TCA循環(huán)的強弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD⁺比值說(shuō)明細胞呼吸耗氧量較高，處于過(guò)氧化狀態(tài)。此外，NADH/NAD⁺比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環(huán)。另外，NAD⁺降解產(chǎn)物對細胞信號傳導、代謝和基因表達等具有重要的調控作用。

測定原理：

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD⁺和NADH，NADH通過(guò)PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍（MTT）為甲瓚，在570nm下檢測吸光值；而NAD⁺可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進(jìn)一步采用MTT還原法檢測。

組成：

試劑三：粉劑×1瓶，-20 ℃保存，用時(shí)加入3ml蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃保存一周；

試劑四：粉劑×1瓶，4 ℃保存，用時(shí)加入3ml蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃保存一周；

自備儀器和用品：

酶標儀、臺式離心機、移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

NAD+和NADH的提?。?/span>

1、 血清（漿）中NAD⁺和NADH的提取

NAD⁺的提取：按照血清（漿）體積（ml）：酸性提取液體積（ml）為1：5~10的比例（建議取約0.1ml血清（漿），加入1ml酸性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μl上清液，加入500μl堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADH的提取：按照血清（漿）體積（ml）：堿性提取液體積（ml）為1：5~10的比例（建議取約0.1ml血清（漿），加入1ml堿性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μl上清液，加入500μl酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（ml）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1ml酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μl上清液，加入500μl堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADH的提取：按照組織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（ml）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1ml堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μl上清液，加入500μl酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、 細胞或細菌中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：先收集細胞或細菌到離心管內，棄上清，按照細菌或細胞數量（10⁴個(gè)）：酸性提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1ml酸性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μl上清液，加入500μl堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADH的提取：先收集細胞或細菌到離心管內，棄上清，按照細菌或細胞數量（10⁴個(gè)）：堿性提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1ml堿性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μl上清液，加入500μl酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至570nm，蒸餾水調零。

2、 加樣表(在1.5ml棕色EP管中按下表依次加樣）：

充分混勻，靜置5min后，20000g，25℃離心5min，棄上清，沉淀中加入：

混勻，取200μl轉移至微量石英比色皿或96孔板中，570nm下讀取對照吸光值A1和測定管吸光值A2，計算△A=A2-A1。

注意事項:

1、如果一次性測定樣本數較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區別：對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應20min后再加試劑六。

3、反應過(guò)程中注意避光。

4、若NAD+測定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH測定中△A（A2-A1）≤0.0222，說(shuō)明樣本中輔酶含量較低，已低于檢測限，可做如下調整：（1）將測定管避光靜置時(shí)間20min延長(cháng)到60min；（2）在提取階段增加取樣量，即取0.2g樣本或0.2ml樣本加入1ml提取液。

5、由于每一個(gè)測定管需要設一個(gè)對照管，本試劑盒100管保證測48個(gè)NAD⁺或NADH.

NAD+和NADH含量的計算:

（一） NAD⁺含量的計算

標準條件下的回歸曲線(xiàn)為y = 0.1475x + 0.0302，R² = 0.9978；其中y為△A，x為NAD⁺濃度nmol/ml

1、血清（漿）中NAD⁺含量計算

NAD⁺含量(nmol/ml）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302）

2、組織、細菌或細胞中NAD⁺含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NAD⁺ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NAD⁺ (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302）÷W

 (3)按細菌或細胞密度計算

NAD⁺ (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302）

（二）NADH含量的計算

標準條件下的回歸曲線(xiàn)為y = 0.1404x + 0.0222，R² = 0.9976；其中y為△A，x為NADH濃度nmol/ml

1、血清（漿）中NADH含量計算

NADH含量(nmol/ml）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222）

2、組織、細菌或細胞中NADH含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NADH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222）÷W

(3)按細菌或細胞密度計算

NADH (nmol/10⁴ cell）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222）

V1：加入反應體系中樣本體積，0.02ml；V2：加入提取液體積，2ml；V3：加入血清（漿）體積：0.1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml； W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wàn)。

注意：最低檢測限為0.1nmol/ml或0.1nmol/g鮮重 或0.001nmol/mg prot