正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養細胞中，線(xiàn)粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋(píng)果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋(píng)果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細胞多種生理活動(dòng)中扮演著(zhù)重要的角色，包括線(xiàn)粒體的能量代謝、 蘋(píng)果酸-天冬氨酸穿梭系統、活性氧代謝和抗病性等。根據不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴(lài)的MDH和NADP-依賴(lài)的MDH， NADP-MDH主要存在于真核細胞中。

測定原理：

NADP-MDH催化NADPH還原草酰乙酸生成蘋(píng)果酸，導致340nm處光吸收下降。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

樣本測定的準備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1ml試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至340nm，蒸餾水調零。

2、檢測工作液的配制：用時(shí)在試劑三中加入19ml試劑二和0.5ml蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

3、測定前將檢測工作液在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

4、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μl樣本和195μl工作液，混勻后立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

注意：若A1-A2大于0.5，需將酶液用提取液稀釋?zhuān)?/span>A1-A2小于0.5，可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應稀釋倍數。

NADP-MDH活力單位的計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）NADP-MDH活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/ml）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=6430×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NADP-MDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T =6430×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（V樣÷V樣總×500）÷T=12.86×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.005ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；500：細胞或細菌總數，500萬(wàn)。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）NADP-MDH活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/ml）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=12860×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NADP-MDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =12860×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=25.72×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.005ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；500：細胞或細菌總數，500萬(wàn)。