正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

ME廣泛存在于微生物、培養細胞、動(dòng)物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋(píng)果酸氧化脫羧的可逆反應，產(chǎn)生丙酮酸和CO2，以及伴隨NAD(P)+的還原反應，是蘋(píng)果酸代謝的關(guān)鍵酶。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來(lái)植物ME活性測定較多，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn)。根據輔酶專(zhuān)一性和對底物特異性的不同，可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。

測定原理：

NADP-ME催化NADP+還原成NADPH，在340nm下測定NADPH增加速率。

組成：

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存； 臨用前加入20ml試劑一充分振蕩，溶解待用，用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入2.5ml蒸餾水充分振蕩，溶解待用，用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復凍融。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；14000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。14000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至340nm，蒸餾水調零。

2、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl樣本和170μl試劑二，混勻，30℃孵育5min，加入20μl試劑三，混勻后立即記錄340nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

NADP-ME活性計算：

（a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T= 3215×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T = 3215×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T =6.43×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T= 6431×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T = 6431×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T =12.86×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。