測定意義：

NADPase主要存在于植物組織中，是生物體內唯一催化NADP+降解為NAD+的酶，與NADK一起調控NAD和NADP之間的平衡。

測定原理：

NADPase能夠催化NADP+水解為NAD+和無(wú)機磷的反應，通過(guò)測定無(wú)機磷的量來(lái)測定NADPase活性。

組成：

試劑二：粉劑×4支，-20℃保存；用時(shí)加入1 ml試劑一充分溶解備用，現配現用。

試劑三：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25ml蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。

試劑四：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25ml蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。

試劑六：10mmol/L 標準磷貯備液 10ml×1 瓶，4℃保存。

0.5μmol/ml 標準磷應用液配制：將試劑六20倍稀釋?zhuān)慈?0.5ml試劑六加9.5蒸餾水，充分混勻。

定磷試劑的配制：按H₂O: 試劑三:試劑四:試劑五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應為淺黃色，若無(wú)色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現用現配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

樣本的前處理：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至660nm，蒸餾水調零。

2、酶促反應（在EP管中加入下列試劑）

37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）預熱5min

37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準確反應30min后，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10000g 25℃離心5min，取上清

3、定磷（在EP管或96孔板中加入下列試劑）

混勻，25℃室溫放置30min，在 660nm處，記錄各管吸光值。

注意事項：

1、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對測定所用試管要求嚴格，要沒(méi)有一點(diǎn)磷，若試管放過(guò)磷酸或磷酸鹽緩沖液，一定要洗得非常干凈，要先用洗潔精加水煮，再用自來(lái)水沖，最后用蒸餾水沖干凈。最好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是檢測成敗的關(guān)鍵。

2、標準管、空白管和對照管只要做一次即可。

NADPase酶活性計算：

1、按組織蛋白濃度計算：

定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白NADPase分解NADP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機磷的量為一個(gè) NADPase活力單位。

NADPase (μmol/h/mg prot)=(C標準管×V總)×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷

(V樣×Cpr)÷T=5×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷Cpr

2、按樣本鮮重計算：

定義：每小時(shí)每g組織NADPase分解NADP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機磷的量為一個(gè) NADPase活力單位。

NADPase (μmol/h /g鮮重)=(C標準管×V總)×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管）×V總÷(W× V樣÷V樣總)÷T=5×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷W

C標準管：標準管濃度，0.5μmol/ml；V總：酶促反應總體積，0.2ml；V樣：加入樣本體積，0.04ml ；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應時(shí)間，0.5小時(shí)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重，g。