正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                            

測定意義：

LAP是一類(lèi)能水解肽鏈N-末端為亮氨酸的酶，廣泛存在于肝、腎、胰等組織中，尤其以肝臟中含量最為豐富。各類(lèi)肝病患者因肝細胞損傷，血清LAP的活性均有不同程度的升高，因此，血清LAP活性的檢測能從不同側面反映各種肝病的發(fā)生和發(fā)展。

測定原理：

LAP分解L-亮氨酰對硝基苯胺生成對硝基苯胺，后者在405nm有最大吸收峰，通過(guò)測定吸光值升高速率來(lái)計算LAP活性。

組成：

自備儀器和用品：

酶標儀/可見(jiàn)分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣品的前處理：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為1000~5000：1的比例（建議2000萬(wàn)細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

LAP測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至405nm，蒸餾水調零。

2、將試劑二轉移至試劑一中充分溶解（如較難溶解，可50℃水浴加熱約30min促進(jìn)溶解）；在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

3、在微量石英比色皿或96孔板中加入50μl樣本和150μl試劑一，混勻后立即記錄405nm處初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

注意事項：若ΔA大于0.5，需將酶液用提取液稀釋?zhuān)嬎愎街谐艘韵鄳♂尡稊?。?/span>A2-A1小于0.5，可提高檢測靈敏度。

LAP活力單位的計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）LAP活力的計算:

單位的定義：每ml血清（漿）每分鐘生成1 nmol的對硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min/ml）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=205.8×ΔA

2、組織、細菌或細胞中LAP活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=205.8×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V樣÷V樣總) ÷T=0.103×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：對硝基苯胺摩爾消光系數，9.72×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細菌或細胞總數，2000萬(wàn)。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）LAP活力的計算:

單位的定義：每ml血清（漿）每分鐘生成1 nmol的對硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /ml）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=411.5×ΔA

2、組織、細菌或細胞中LAP活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷ (V樣×Cpr) ÷T=411.5×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=411.5×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

LAP（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V樣÷V樣總) ÷T=0.206×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：對硝基苯胺摩爾消光系數，9.72×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.05 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細菌或細胞總數，2000萬(wàn)。

GOT（nmol/min/mg prot）=[（ΔA+0.0013）÷0.2384×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ =209.7×（ΔA+0.0013）÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GOT（nmol/min/g鮮重）=[（ΔA+0.0013）÷0.2384×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ =209.7×（ΔA+0.0013）÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GOT（nmol/min/10⁴ cell）= [（ΔA+0.0013）÷0.2384×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×10³ =0.419×（ΔA+0.0013）

V1：加入反應體系中樣本體積，0.01ml；V2：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，20 min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wàn)；10³：1umol/ml=10³ nmol/ml。

1、標準曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍為：0.01 umol/ml -2 umol/ml。

2、ΔA線(xiàn)性范圍為：0.01 -1。