正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                           

測定意義：

動(dòng)物肝臟、腎臟是氨基酸代謝的主要器官，故尿中氨基酸的變化最能反應肝、腎的生理狀態(tài)。另外，氨基酸還能反應灼傷、傷寒等方面情況。植物體內氨基酸含量對研究植物在不同條件下及不同生長(cháng)發(fā)育時(shí)期氮代謝變化、植物對氮素的吸收、運輸、同化及營(yíng)養狀況等有重要意義。

測定原理：

氨基酸的α -氨基可與水合茚三酮反應，產(chǎn)生藍紫色化合物，在570 nm有特征吸收峰；通過(guò)測定570 nm吸光度，來(lái)計算氨基酸含量。

組成：

試劑三臨用前加入667μl無(wú)水乙醇，蓋緊后充分混勻，再加入9.333ml蒸餾水混勻，避光保存。

試劑四臨用前加1ml蒸餾水，充分溶解。

標準品臨用前加10ml蒸餾水，充分溶解。1μmol/mL標準液，4℃避光保存。

自備儀器和用品：

臺式離心機、水浴鍋、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽、無(wú)水乙醇、冰和蒸餾水。

樣品中AA提?。?/span>

1、按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行室溫勻漿，然后轉移到1.5ml EP 管中，蓋緊后（防止水分散失）置于沸水浴提取15 min；自來(lái)水冷卻后，8000g，，4℃離心10min，上清液置冰上待測。

2、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清等液體：直接檢測。

測定步驟：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調節波長(cháng)到570 nm，蒸餾水調零。

2. 空白管：取EP管，加入10μl蒸餾水，100μl試劑二，100μl試劑三和10μl試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min，冷卻后反復顛倒EP管數次，于570nm測定吸光值，記為A空白管。顯色后務(wù)必在30min內測完。

3. 標準管：取EP管，加入10μl標準品，100μl試劑二，100μl試劑三和10μl試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min，冷卻后反復顛倒EP管數次，于570nm測定吸光值，記為A標準管。顯色后務(wù)必在30min內測完。

4. 測定管：取EP管，加入10μl上清液，100μl試劑二，100μl試劑三和10μl試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min，冷卻后反復顛倒EP管數次，于570nm測定吸光值，記為A測定管。顯色后務(wù)必在30min內測完。

注意：空白管和標準管只需要測定一次。

氨基酸含量計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

氨基酸含量（μmol /mg prot）= [C標準品×V標準品×(A測定－A空白)÷(A標準－A空白)]÷（V樣×Cpr）

=1×(A測定－A空白)÷(A標準－A空白) ÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

氨基酸含量（μmol /g 鮮重）=[C標準品×V標準品×(A測定－A空白)÷(A標準－A空白)] ÷（V樣總÷V樣）÷W

=1×(A測定－A空白)÷(A標準－A空白) ÷W

（3）按細胞數量計算

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）=[C標準品×V標準品×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)] ×（V樣總÷V樣×細胞數量）

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷細胞數量

（4）按照液體體積計算

氨基酸含量（μmol /mL）=[C標準品×V標準品×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]÷V樣

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)

C標準品：標準品濃度，1 μmol/mL；V標準品：反應體系中加入標準品體積，0.01ml；W：樣品質(zhì)量，g；V樣：反應體系中加入樣品提取液體積，0.01ml；V樣總：樣品提取液總體積，1mL；；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

氨基酸含量（μmol /mg prot）=[C標準品×V標準品×(A測定－A空白)÷(A標準－A空白)] ÷（V樣×Cpr）

=1×(A測定－A空白)÷(A標準－A空白) ÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

氨基酸含量（μmol /g 鮮重）=[C標準品×V標準品×(A測定－A空白)÷(A標準－A空白)]×（V樣總÷V樣）÷W

=1×(A測定－A空白)÷(A標準－A空白) ÷W

（3）按細胞數量計算

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）= [C標準品×V標準品×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)] ×（V樣總÷V樣×細胞數量）

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷細胞數量

（4）按照液體體積計算

氨基酸含量（μmol /mL）=[C標準品×V標準品×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]÷V樣

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)

C標準品：標準品濃度，1 μmol/mL；V標準品：反應體系中加入標準品體積，0.01ml；W：樣品質(zhì)量，g；V樣：反應體系中加入樣品提取液體積，0.01mL；V樣總：樣品提取液總體積，1mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

注意事項：

1. 試劑盒中試劑三、試劑四和標準品均需臨用前配制，且避光保存，配制好未使用完的4℃保存且3天內使用完畢。

2. 為保證實(shí)驗結果的準確性，需先取1-2個(gè)樣做預實(shí)驗，如果測定的吸光值過(guò)高（高于2.5），用蒸餾水稀釋后再測定。

3. 脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應在570nm處無(wú)吸收峰，因此，570nm處測定結果不含這兩種氨基酸的量。

4．最低檢出限為100μmol/L。