測定意義：

GCDH（EC 1.1.1.47）催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H，大量存在于高等動(dòng)物的肝臟和弱氧化醋桿菌中。在低聚果糖生產(chǎn)中使用GCDH，不僅能去除低聚果糖中的葡萄糖提高低聚果糖的含量，而且生成的葡萄糖酸與鈣離子結合生成的葡萄糖酸鈣是一種理

想的補鈣制劑。因而，GCDH已成為制備高含量低聚果糖的理想用酶。

測定原理：

GCDH催化D-葡萄糖和NAD生成D-葡萄糖酸和NADH，在340nm下測定NADH上升速率，即可反映GCDH活性。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織的前處理：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

細菌或培養細胞的前處理：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至340nm，蒸餾水調零；

2、 工作液的配制：臨用前將試劑二轉移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑4℃可保存一周；

3、 將工作液置于37℃預熱5分鐘。

4、 在1ml石英比色皿中加入10μl樣本和190μl工作液，立即混勻，記錄340nm處初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

GCDH活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GCDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GCDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3215×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GCDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=6.43×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。

b.用96孔板測定的計算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GCDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GCDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=6430×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GCDH（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=12.86×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.05cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。