測定意義：

SDH（EC 1.3.5.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養細胞中。SDH是線(xiàn)粒體的一種標志酶，位于線(xiàn)粒體內膜上的一種膜結合酶，是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一。此外，為多種原核細胞產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子。

測定原理：

SDH催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，脫下的氫通過(guò)吩嗪二甲酯硫酸（PMS）傳遞還原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm處具有特征吸收峰，通過(guò)600nm吸光度的變化，測定2．6-DPIP的還原速度，代表SDH酶活性。

組成：

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線(xiàn)粒體蛋白的分離：

1、 稱(chēng)取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細胞，加入1ml試劑一和10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿600g，4℃離心5min。

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4、 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線(xiàn)粒體泄漏的SDH（此步可選做）。

5、 在步驟④的沉淀中加入200μl試劑二和2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復30次），用于線(xiàn)粒體SDH活性測定。

測定步驟和加樣表：

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至600nm，蒸餾水調零。

2、 樣本測定

（1）在試劑四中加入18ml蒸餾水充分溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

（2）在試劑五中加入1ml蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl樣本、10μl試劑五和180μl試劑四，混勻，立即記錄600nm處20s時(shí)的吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

SDH活性的計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

 SDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T=952×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=192×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.385×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

 SDH活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1904×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=384×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.77×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。