測定意義：

ICDHm（EC 1.1.1.41）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養細胞的線(xiàn)粒體中，在三羧酸循中催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸，同時(shí)將NAD⁺ 還原為NADH，是三羧酸循環(huán)的限速酶之一，其催化的反應是細胞NADH主要來(lái)源之一。

測定原理：

ICDHm催化NAD⁺ 還原生成NADH，導致340nm處光吸收上升。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線(xiàn)粒體蛋白的分離：

1、 稱(chēng)取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細胞，加入1ml試劑一和10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿600g，4℃離心5min。

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4、 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線(xiàn)粒體泄漏的ICDHm（此步可選做）。

5、 在步驟④的沉淀中加入200μl試劑二和2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復30次），用于線(xiàn)粒體ICDHm活性測定。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至340nm，蒸餾水調零。

2、 樣本測定

（1）在試劑五中加入18ml試劑四充分溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

（2）在試劑六中加入1ml蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl樣本、10μl試劑六和180μl試劑五，混勻，立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

ICDHm活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。

 ICDHm活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。

 ICDHm（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=325×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。

ICDHm活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.65×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。

 ICDHm活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。

 ICDHm（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=650×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞在反應體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。

ICDHm活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.3×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。