測定意義：

C4H又稱(chēng)反式肉桂酸-4-單氧化酶，多存在于高等植物、酵母、菌類(lèi)中，該酶催化肉桂酸羥化作用產(chǎn)生4-香豆酸鹽，是苯丙烷途徑中繼L-苯丙氨酸解氨酶之后的第二個(gè)關(guān)鍵酶。

測定原理：

C4H催化肉桂酸和NADP生成4-香豆酸鹽和NADPH，在340nm下測定NADPH生成速率，即可反映C4H活性。

試劑的組成和配制：

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1ml石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

細菌或培養細胞：

先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至340nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定

（1）取試劑二一瓶，加入25ml試劑一充分溶解混勻，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min；現配現用（配好后24h內用完）；

（2）在1ml石英比色皿中加入50μl樣本和950μl試劑二，混勻，立即記錄340nm處初始吸光值A1和 5min后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

C4H活性計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

C4H（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

C4H（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

C4H（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.286×ΔA

V反總：反應體系總體積，1×10-3 L；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。