測定意義：

ACC在生物體內催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A，是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。ACC的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

測定原理：

ACC能夠催化乙酰輔酶A、NaHCO₃和ATP生成丙二酰輔酶A、ATP和無(wú)機磷，通過(guò)鉬酸銨定磷法測定無(wú)機磷的增加量來(lái)測定ACC活性。

組成：

試劑四：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25ml蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。

試劑五：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25ml蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。

試劑七：10μmol/ml 標準磷貯備液 10ml×1 瓶，4℃保存。

自備儀器和用品：

分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 ml玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理:

1、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟:

1、 分光光度計預熱30min以上，調節波長(cháng)至660nm，蒸餾水調零。

2、 酶促反應試劑的配制和預熱：在試劑二瓶中加入6.5ml試劑一，充分溶解混勻；在試劑三瓶中加入5ml蒸餾水，充分溶解混勻；將試劑一、二、三在37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預熱10分鐘。

3、定磷試劑的配制：按H₂O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑

              應為淺黃色，若無(wú)色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現用現配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

4、0.5μmol/ml 標準磷應用液配制：將試劑七20倍稀釋?zhuān)慈?0.5ml試劑七加9.5蒸餾水，充分混勻。

5、酶促反應

37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準確反應30min后，90℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10000g 25℃離心5min，取上清

6、定磷

混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴30min，冷卻至室溫，在 660nm處，蒸餾水調零，記錄各管吸光值A。標準管、空白管只要做一次即可，每個(gè)測定管需要設一個(gè)對照管。

注意：若測定管吸光值大于2，將樣品用提取液稀釋適當倍數后再進(jìn)行測定，使吸光值小于2，可提高檢測靈敏度，計算公式中乘以相應稀釋倍數。

ACC活性計算：

1、按組織蛋白濃度計算：

定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白產(chǎn)生1μmol無(wú)機磷的量為一個(gè) ACC活力單位。

ACC (μmol/h/mg prot)=(C標準管×V總)×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷

(V樣×Cpr)÷T=10×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷Cpr

2、按樣本鮮重計算：

定義：每小時(shí)每g組織產(chǎn)生1μmol無(wú)機磷的量為一個(gè) ACC活力單位。

ACC (μmol/h/g鮮重)=(C標準管×V總)×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管）÷

(W× V樣÷V樣總)÷T=10×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷W

3、 按細菌或細胞密度計算：

定義：每小時(shí)每500萬(wàn)細菌或細胞產(chǎn)生1μmol無(wú)機磷的量為一個(gè) ACC活力單位。

ACC (μmol/h/10⁴ cell)=(C標準管×V總)×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管）÷

(500× V樣÷V樣總)÷T=0.02×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)

C標準管：標準管濃度，0.5μmol/ml；V總：酶促反應總體積，0.5ml；V樣：加入樣本體積，0.05ml ；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應時(shí)間，0.5小時(shí)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。