正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

游離脂肪酸，也稱(chēng)為非酯化脂肪酸，在與白蛋白結合的血漿中循環(huán)。動(dòng)物血液中的游離脂肪酸 (FFA )含量是一項重要的生理生化指標。血清中游離脂肪酸的濃度與脂類(lèi)代謝、糖代謝、內分泌功能有關(guān)，游離脂肪酸的濃度會(huì )因為糖尿病、重癥肝障礙、甲狀腺功能亢進(jìn)等疾病而上升。

測定原理：

用有機溶劑萃取FFA。含有FFA的有機液與三乙醇胺銅反應,在有機相中形成脂肪酸銅 (銅皂) FFA一Cu。Cu離子與顯色液反應形成紫紅色絡(luò )合物。反應形成的顏色深淺與Cu離子濃度的關(guān)系符合朗伯一比爾定律，因此可利用此反應進(jìn)行比色。

組成：

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計、離心機、可調式移液器、玻璃比色皿、蒸餾水。

樣本前處理：

1.動(dòng)物組織：按照動(dòng)物組織質(zhì)量（g）：萃取液ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml萃取液），進(jìn)行冰浴勻漿。震蕩提取15min，5000 rpm 4℃離心5min，取有機相待測。

2.血清：吸取50 μl血清樣本，加入1 ml萃取液，震蕩提取15 min后，4℃，5000 rpm離心5 min，取有機相待測。

3.微生物、細胞：按照細胞數量（10⁴個(gè)）：萃取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細胞加入1 ml萃取液）加入萃取液，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲2秒，間隔3秒，總時(shí)間3min）；震蕩提取15 min，然后5000 rpm 4℃離心5min，取有機相待測。

注意：有機相待測液可能存在于上層，也可能存在于下層，注意觀(guān)察，體積較多的那一層即為有機相待測液。

測定步驟：

1、 分光光度計預熱30min以上，調節波長(cháng)至550 nm。

2、 工作液的配制：臨用前根據用量按照試劑一（V）：試劑二（V）：試劑三（m）=1（ml）1（ml）：0.66（g）的比例充分混勻。（注意：現用現配，用多少配多少，在空瓶中配制，試劑盒中帶有4個(gè)空瓶，先將試劑一與試劑二混合，最后再加入試劑三粉劑）

3、測定管：吸取750μl樣本，加入250μl工作液，蓋緊后震蕩20 min，4℃，5000 rpm離心5 min，分層后取600μl上層有機相，加入300μl試劑四，搖勻，10 min后于玻璃比色皿中測定550 nm的吸光值，記為A測定。

4、空白管：吸取750μl萃取液，加入250μl工作液，蓋緊后震蕩20 min，4℃，5000 rpm離心5 min，分層后取600μl上層有機相，加入300μl試劑四，搖勻，10 min后于玻璃比色皿中測定550 nm的吸光值，記為A測定?？瞻坠苤恍铚y一次。

空白管只需測一次。△A=A測定-A空白

注意：1、有機溶劑易揮發(fā)，加入比色皿后應盡快檢測。

2、測定管中加入的樣本即樣本前處理中的有機相待測液。

FFA含量計算：

標準曲線(xiàn)：y = 0.0322x - 0.0141     R² = 0.9985   x：棕櫚酸標準品濃度（nmol/ml）

                                            y：吸光值差值△A

1、血清FFA含量計算：

FFA含量(μmol/ml)=(△A+0.0141)÷0.0322×V1÷(V3×V1÷V2)÷1000

                 =0.621×(△A+0.0141)

2、動(dòng)物組織、微生物、細胞中FFA含量計算：

（1）按樣本質(zhì)量計算

FFA含量(μmol/g鮮重)=(△A+0.0141)÷0.0322×V1÷（W× V1÷V2）÷1000

                =0.031×(△A+0.0141)÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算

FFA含量(μmo/mg prot)= (△A+0.0141)÷0.0322×V1÷(V1×Cpr)÷1000

                =0.031×(△A+0.0141)÷Cpr

V1：加入樣本體積，0.75 ml；V2：萃取液體積，1ml；V3：加入血清（漿）體積，0.05 ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：動(dòng)物組織樣品質(zhì)量，g； 1000：1 μmol=1000 nmol 。

注意事項：

蛋白含量不可直接用萃取液提取的有機相待測液直接測定，可用蒸餾水或緩沖液或生理鹽水選用本公司的BCA法蛋白含量測定試劑盒。

最低檢出限為10 nmol/ml。