測定意義：

AAT是一個(gè)多功能蛋白大家族，主要負責催化生物體內各種?；腿ヵ；磻?，在基因表達、代謝和信號傳導中具有重要作用。

測定原理：

AAT催化乙酰CoA轉移乙?；蕉〈?，釋放的CoA還原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，測定412 nm吸光度增加速率可計算AAT活性。

組成：

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺式離心機、可見(jiàn)分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、無(wú)水乙醇。

粗酶液提?。?/span>

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細胞加入1ml提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

2. 液體：直接檢測。

AAT測定操作：

1、分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長(cháng)到412 nm，蒸餾水調零。

2、工作液的配制：臨用前在試劑二瓶中加入18ml試劑一，充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

3、試劑三的配制：臨用前加無(wú)水乙醇1ml充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存。

4、 空白管：在Ep管或96孔板中加入10μL提取液和180μL工作液，充分混勻，35℃反應15min，加入10μL試劑三，充分混勻，25℃靜置10min，測定412nm處吸光值，記為A空白管。

5、 測定管：在Ep管或96孔板中加入10μL樣本和180μL工作液，充分混勻，35℃反應15min，加入10μL試劑三，充分混勻，25℃靜置10min，測定412nm處吸光值，記為A測定管。△A=A測定管- A空白管，空白管只要做一管。

AAT活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。

AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷（×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T = 98.04×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。

AAT (nmol/min /g 鮮重) = △A ÷（×d）×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ÷T

= 98.04×△A÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義：每10⁴個(gè)細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。

AAT (nmol/min/10⁴cell) = △A ÷（×d）×V反總÷(細胞數量×V樣÷V樣總) ÷T

= 98.04×△A÷ 細胞數量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：每毫升樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。

AAT (nmol/min/ml) = △A ÷（×d）×V反總÷V樣÷T

 = 98.04×△A

：TNB消光系數，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑：1cm；V反總：反應總體積，0.2ml；V樣：加入反應體系中上清液體積，0.01ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：蛋白含量，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應時(shí)間，15 min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。

AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷（×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

=196.08×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。

AAT (nmol/min /g 鮮重) = △A ÷（×d）×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ÷T

= 196.08×△A÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義：每10⁴個(gè)細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。

AAT (nmol/min/10⁴cell) = △A ÷（×d）×V反總÷(細胞數量×V樣÷V樣總) ÷T

=196.08×△A÷ 細胞數量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：每毫升樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。

AAT (nmol/min/ml) = △A ÷（×d）×V反總÷V樣÷T

 = 196.08×△A

：TNB消光系數，13600L/mol/cm；d：96孔板光徑：0.5cm；V反總：反應總體積，0.2ml；V樣：加入反應體系中上清液體積，0.01ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：蛋白含量，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應時(shí)間，15min。