正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

磷脂酶D（EC3.1.4.4）即磷脂酰膽堿水解酶，是催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換反應的一類(lèi)酶的總稱(chēng)，廣泛存在于高等動(dòng)植物和細菌等多種生物體中，具有參與細胞脂質(zhì)代謝、信號傳導、生物膜形成的抗逆境脅等生理功能。

測定原理：

磷脂酶D催化水解磷脂酰膽堿末端的磷脂酰二酯鍵生成磷脂酸和膽堿，膽堿在膽堿氧化酶催化作用下生成甜菜堿和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在過(guò)氧化氫酶的作用下將4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉紅色物質(zhì)，在500nm處有特征吸收峰。

組成：

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加3ml無(wú)水乙醇充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

自備儀器和用品：

天平、研缽、超速冷凍離心機、可見(jiàn)分光光度計、1 ml玻璃比色皿、恒溫水浴鍋，無(wú)水乙醇。

酶液提取

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入1ml提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1ml試劑一。

2. 細胞：按照細胞數量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細胞加入1ml提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后于4℃，10000g離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1ml試劑一。

3. 血清：直接測定。                   

測定操作

酶活計算公式

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量一個(gè)酶活力單位。

PLD活性（nmol/min/mg prot）= ×C標準÷Cpr÷T= 16.7 ×÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量一個(gè)酶活力單位。

PLD活性（nmol/min/g 鮮重）=  ×C標準÷W÷T = 16.7×÷W

3．按照細胞數量計算

酶活性定義：每10⁴個(gè)細胞每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量一個(gè)酶活力單位。

PLD活性（nmol/min/10⁴ cell）= ×C標準÷細胞數量÷T = 16.7×÷細胞數量

4．按照液體體積計算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量一個(gè)酶活力單位。

PLD活性（nmol/min/ml）=  ×C標準÷T=16.7×

C標準：標準品濃度，500nmol/ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g/ml；T：反應時(shí)間，30min

注意事項

1. 顯色完成后，若有沉淀，于8000g，25℃離心5min后取上清測定。

2. 吸光值不宜超過(guò)1，否則用試劑一將酶液進(jìn)行稀釋?zhuān)⒃谟嬎愎街谐艘韵♂尡稊怠?/span>