正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

磷脂酶A2（EC3.1.1.4）是磷脂sn-2位脂?；饷?，廣泛存在于動(dòng)植物組織、細菌、細胞核分泌物中，參與脂肪消化，精子成熟、細胞信號傳遞、脂質(zhì)過(guò)氧化修復、宿主反應等生理過(guò)程，在控制體內磷脂類(lèi)物質(zhì)平衡、調節機體新陳代謝、參與疾病的病理進(jìn)程等方面發(fā)揮著(zhù)及其重要的作用。

測定原理：

磷脂酶A2作用于2-硫代十六酰乙基磷酸膽堿（HEPC）產(chǎn)生游離巰基，與DTNB反應生成黃色物質(zhì)，在412nm處有特征吸收峰。

組成：

試劑三：液體×5瓶，-20℃避光保存。臨用前根據用量每瓶加入4.5mL試劑二充分混勻；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

自備儀器和用品：

天平、超速冷凍離心機、研缽、可見(jiàn)分光光度計、1 ml玻璃比色皿。

樣品處理：

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

2. 細胞：按照細胞數量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后于4℃，10000g離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

3. 血清：直接測定。

測定操作：

計算公式：

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 73.53×△A÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/g 鮮重）= △A÷（×d）×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

= 73.53×△A÷W

3. 細胞數量計算

酶活性定義：每10⁴個(gè)細胞每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/10⁴ cell）= △A÷（×d）×V反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T

                     = 73.53×△A÷細胞數量

4按照液體體積計算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/mL）= △A÷（×d）×V反總÷V樣÷T

= 73.53×△A

：TNB消光系數，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應總體積，1mL；V樣：反應體系中加入樣本體積，0.1mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL；

T：反應時(shí)間，10min