測定意義：

肉毒堿棕櫚酰轉移酶是存在于線(xiàn)粒體內膜的一類(lèi)?；D移酶?？赡娴卮呋瘡孽；o酶A將?；D移至L-肉毒堿的反應，在轉運脂肪酸通過(guò)線(xiàn)粒體內膜的過(guò)程中起重要作用。

測定原理：

基于肉堿和脂酰輔酶A在丙二酰輔酶A存在與否的條件下，通過(guò)肉堿脂酰轉移酶(CPT-I)的作用，產(chǎn)生脂酰肉堿，并釋放出巰基輔酶A(COA-SH)，與Ellman試劑DN-TB反應后，產(chǎn)生黃色的TNB。通過(guò)其吸收峰值得變化（412nm），來(lái)定量分析CPT-1的活性。

組成：

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、無(wú)水乙醇和蒸餾水

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線(xiàn)粒體蛋白的分離：

① 稱(chēng)取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細胞，加入1ml試劑一和10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿液于600g，4℃離心5min。

③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

④ 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線(xiàn)粒體泄漏的CPT-1（此步可選做）。

⑤ 在步驟④的沉淀中加入200μl試劑二和2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復30次），用于線(xiàn)粒體CPT-1測定。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至412nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定

（1）在試劑五中加入1ml無(wú)水乙醇，混勻，再加入22ml試劑四，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

（2）在試劑六中加入1ml蒸餾水，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl樣本、220μl試劑五和10μl試劑六，混勻，記錄412nm處20秒時(shí)的初始吸光度A1和2分20秒時(shí)的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。

CPT-1活性計算：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=177.8×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.3556×ΔA

V反總：反應體系總體積，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩爾消光系數，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wàn)。

b. 使用96孔板測定的計算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T=355.6×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.711×ΔA

V反總：反應體系總體積，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩爾消光系數，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wàn)。