測定意義：

果膠酶（pectinase）是一類(lèi)分解果膠質(zhì)酶類(lèi)的總稱(chēng)，包括原果膠酶，果膠酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶四大類(lèi)，廣泛存在于植物果實(shí)和微生物中，主要用于食品、釀酒、環(huán)保、醫藥、紡織及日化用品行業(yè)。

測定原理：

果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸，具有還原性醛基，與DNS試劑反應生成紅棕色物質(zhì)，在540nm有特征吸收峰，測定540nm處吸光值變化可計算得果膠酶活性。

試劑組成和配制：

試劑二：粉劑×2瓶，4℃保存；臨用前加入7.5ml試劑一，50℃加熱溶解，用不完的試劑4℃保存一周。

需自備儀器和用品：

天平、低溫離心機、可見(jiàn)分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

酶液提?。?/span>

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、細菌、真菌：按照細胞數量（104個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細胞加入1ml提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。

3、細胞培養液等：直接檢測。

測定步驟：

50℃水浴溫育5min

混勻，50℃水浴反應30min

沸水浴5min，冰浴冷卻終止反應，8000g，4℃，離心10min，蒸餾水調零，取上清于微量石英比色皿或96孔板測定540nm處吸光值A，△A=A測定管-A對照管。每個(gè)測定管需設一個(gè)對照管。

注意事項：

1、試劑二若有沉淀析出，請置于50℃加熱溶解。

2、測定之前請先做預實(shí)驗，如果吸光值較高或較低，請用提取液做適當的稀釋或者加大樣本量，并在計算公式中乘以稀釋倍數或者以實(shí)際加入的樣本體積參與計算。

煮沸樣本建議在沸水中煮沸10分鐘，以將酶徹底滅活。

酶活性計算公式：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線(xiàn)：y = 3.9642x - 0.008；R2 = 0.9996；x為標準品濃度，mg/ml；y為吸光值。

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每毫克蛋白每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/mg prot）= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每克樣本每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /g 鮮重）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

3. 按細胞數量計算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每104細胞每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /104cell）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷細胞數量

4．細胞培養液

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每毫升培養液每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /ml）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷V樣÷T=2.523×(ΔA+0.008)

V反總：反應總體積，0.15ml；V樣：反應中樣本體積，0.03ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應時(shí)間，0.5h

b.用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線(xiàn)：y = 1.9821x - 0.008，R2 = 0.9996；x為標準品濃度，mg/ml；y為吸光值。

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每毫克蛋白每小時(shí)分解果膠產(chǎn)。生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/mg prot）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每克樣本每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/g 鮮重）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷W

3. 按細胞數量計算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每104細胞每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /104cell）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷細胞數量

4．細胞培養液

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每毫升培養液每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/ml）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷V樣÷T=5.045×(ΔA+0.008)

V反總：反應總體積，0.15ml；V樣：反應中樣本體積，0.03ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應時(shí)間，0.5h