測定意義：

植物葉綠體中磷酸丙糖異構酶是光合作用中參與calvin循環(huán)的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮之間的轉化，磷酸二羥丙酮能快速透過(guò)葉綠體的包膜進(jìn)入細胞質(zhì)，并在其中逐步轉化為蔗糖。

測定原理：

磷酸丙糖異構酶將磷酸二羥丙酮轉化為3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛與NAD在3-磷酸甘油醛脫氫酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH，340nm處的吸光度變化反映了磷酸丙糖異構酶的活性的高低。

組成：

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加2ml蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加2 ml蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加2 ml蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

自備儀器和用品：

天平、低溫離心機、研缽、震蕩儀、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板。

酶液提取

①總TPI酶提?。?/span>建議稱(chēng)取約0.1g樣本，加入1ml提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測定。

②胞漿和葉綠體TPI酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5～10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g樣本，加入1ml提取液一），冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用于測定胞漿TPI酶活性，取沉淀加1ml提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測定葉綠體中TPI酶活性。

建議測定總TPI酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的TPI，則按照步驟②提取粗酶液。

測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長(cháng)至340nm，蒸餾水調零。

2. 取微量石英比色皿/96孔板，依次加入120μl試劑一，20μl試劑二，20μl試劑三，20μl試劑四，20μl粗酶液，充分混勻，記錄340nm處10s的吸光值A1和310s的吸光值A2，△A=A2-A1

計算公式:

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

TPI（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

TPI（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

V反總：反應體系總體積，0.2ml；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g

b. 用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

TPI（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

TPI（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T= 643.08×ΔA÷W

V反總：反應體系總體積，0.2ml；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g