測定意義：

TrxR是一種NADPH依賴(lài)的包含FAD結構域的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，與硫氧還蛋白以及NADPH共同構成了硫氧還蛋白系統。TrxR與GR活性類(lèi)似，催化GSSG還原生成GSH，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。

測定原理：

TrxR催化NADPH還原DTNB生成TNB和NADP⁺，TNB在412 nm有特征吸收峰，通過(guò)測定412nm波長(cháng)處TNB的增加速率，即可計算TrxR活性。

組成：

試劑三：粉劑×1管，4℃保存。臨用前加入2ml蒸餾水溶解。

自備儀器和用品：

低溫離心機、可調節移液器、可見(jiàn)分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細胞加入1ml試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3.  血清等液體：直接測定。

TrxR測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調節波長(cháng)到412nm，用蒸餾水調零。

2. 試劑一在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）預熱30min。

3. 空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μl試劑二，20μl試劑三，160μl試劑一，迅速混勻后于412 nm測定10 s和310 s吸光度，記為A1和A2。△A空白管=A2-A1。

4. 測定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μl試劑二，20μl試劑三，140μl試劑一，20μl上清液，迅速混勻后于412 nm測定10 s和310 s吸光度，記為A3和A4。△A測定管=A4-A3。

注意：空白管只需測定一次。

TrxR活性計算公式：

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /mg prot）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

= 147×（△A測定管-△A空白管）÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /g 鮮重）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 147×（△A測定管-△A空白管）÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每10⁴個(gè)細胞每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min/10⁴ cell）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

= 147×（△A測定管-△A空白管）÷ 細胞數量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /ml）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷V樣÷T

= 147×（△A測定管-△A空白管）

ε：TNB在412nm處的微摩爾消光系數，0.0136 L/μ mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積（L），200μl=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測定；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應體系中上清液體積（ml），20μl=0.02 ml；V樣總：提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間（min），5 min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /mg prot）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

= 294×（△A測定管-△A空白管）÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /g 鮮重）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 294×（△A測定管-△A空白管）÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每10⁴個(gè)細胞每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min/10⁴ cell）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

= 294×（△A測定管-△A空白管）÷ 細胞數量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /ml）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷V樣÷T

= 294×（△A測定管-△A空白管）

ε：TNB在412nm處的微摩爾消光系數，0.0136 L/μ mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應體系總體積（L），200μl=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測定；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應體系中上清液體積（ml），20μl=0.02 ml；V樣總：提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間（min），5 min。

注意事項：

測定前須先取1～2個(gè)樣做預實(shí)驗，哺乳動(dòng)物組織及血液制品TrxR活力測定時(shí)，一般須用蒸餾水稀釋5倍左右；測定過(guò)程操作須迅速。

試劑二和試劑三配制好后3天內使用完。