測定意義：

APX是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗壞血酸代謝的關(guān)鍵酶之一。APX具有多種同功酶，分別定位于葉綠體、胞質(zhì)、線(xiàn)粒體、過(guò)氧化物和乙醛酸體，以及過(guò)氧化體和類(lèi)囊體膜上。APX 催化H₂O₂氧化AsA，是植 AsA 的主要消耗者。APX的活性直接影響到AsA的含量，APX與AsA具有一定的負相關(guān)性。

測定原理：

APX 催化H₂O₂氧化AsA，通過(guò)測定AsA氧化速率，來(lái)計算得APX活性。

組成：

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加3 ml蒸餾水充分溶解。

自備儀器和用品：

低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、移液槍、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。13000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測。

測定：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調節波長(cháng)到290nm，用蒸餾水調零。

2. 試劑一在25℃中預熱30min。

3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μl上清液、140μl預熱的試劑一20μl試劑二和20μl試劑三，迅速混勻后在290nm測定10s和130s光吸收A1和A2，△A=A1-A2。

APX活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1)  按樣本蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(Cpr×V樣)÷T

=1786×△A÷ Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每g組織每分鐘氧化1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。

APX(nmol/min/g 鮮重 ) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1786×△A ÷W

ε：AsA在290nm處摩爾吸光系數為2.8×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1 cm；V反總：反應體系總體積（L），200μl=2×10^-4 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應體系中上清液體積（ml），20μl=0.02ml；V樣總：提取液體積，1 ml；T：催化反應時(shí)間（min），2min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1)  按樣本蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(Cpr×V樣)÷T

=3571×△A÷ Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每g組織每分鐘氧化1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。

APX(nmol/min/g 鮮重) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=3571×△A ÷W

ε：AsA在290nm處摩爾吸光系數為2.8×10³ L/mol/cm；d：96孔板光徑（cm），0.5 cm；V反總：反應體系總體積（L），200μl=2×10^-4 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應體系中上清液體積（ml），20μl=0.02ml；V樣總：提取液體積，1 ml；T：催化反應時(shí)間（min），2min。

注意事項：

配制好的試劑二4℃保存，并且3天內使用完。