測定意義：

細胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的酶系，在外源物質(zhì)代謝中，尤其是藥物和毒物的代謝，具有重要作用。ERND在P450酶系中相當于CYP2B亞型，與藥物代謝的去甲基化密切相關(guān)。CYP2B具有催化底物形成非活性易于排泄的代謝產(chǎn)物而具有解毒作用，也可使某些藥物經(jīng)CYP2B代謝活化。

測定原理：

ERND催化紅霉素釋放甲醛，通過(guò)Nash比色測定甲醛含量，即可計算出ERND活性。

組成：

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加50 ml蒸餾水溶解。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加2.6 ml蒸餾水，充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加2.6 ml蒸餾水，充分溶解。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前，加蒸餾水9 ml充分溶解。

標準液：液體×1瓶，-20℃保存。臨用前取1.5 ml EP 管，加入10μl標準液，加990μl蒸餾水，混勻即為0.05 mmol/L標準甲醛溶液，4℃保存。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計、普通離心機，超速離心機、可調式移液槍、1ml玻璃比色皿、蒸餾水和冰。

粗酶液提?。?/span>

1、除去細胞核，線(xiàn)粒體等大分子物質(zhì)：稱(chēng)約0.5g組織，加入1ml試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液，轉入超速離心管中。

2、粗制微粒體：100 000g，4℃，離心60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1ml試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5ml，充分震蕩溶解，即粗酶液，待測。該待測液需當天使用。

測定操作：

1. 分光光度計預熱30 min以上，調節波長(cháng)到412 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預熱30 min。

3. 對照管：取1支EP管，加入50μl粗酶液，850μl試劑二，50μl試劑三，50μl蒸餾水，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入175μl試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入175μl試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取新的EP管，加入500μl上清液，500μl試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A對照管。

4. 測定管：取1支EP管，加入50μl粗酶液，850μl試劑二，50μl試劑三，50μl試劑四，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入175μl試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入175μl試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取1支新EP管，加入500μl上清液，500μl試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A測定管。

5. 標準管：取1支EP管，加入500μl標準品，500μl試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A標準管。

注意：每個(gè)樣品都需要做對照管。

ERND活性計算公式：

(1) 按照蛋白濃度計算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個(gè)酶活單位。

ERND活性(nmol/min/mg prot) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數÷（Cpr×V樣）÷T

= 45×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷Cpr。

(2). 按照樣本質(zhì)量計算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個(gè)酶活單位。

ERND活性(nmol/min/g 鮮重) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數÷（W×V樣）÷T

= 45×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷W

C標準品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V標準品：500μl=0.0005 L；稀釋倍數：V反總÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度，mg/ml，需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；V樣：加入粗酶液體積，50μl=0.05ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：催化反應時(shí)間，30min。