正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

NO（Nitric Oxide，NO）廣泛分布于生物體內神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統中，特別是神經(jīng)組織中較豐富。它作為細胞間及細胞內的信息物質(zhì)，發(fā)揮信號傳遞的作用，是一種新型的生物信使分子，在機體的生理、病理過(guò)程中起著(zhù)重要的作用。

測定原理：

NO在體內或水溶液中極易氧化生成NO₂^—，在酸性條件下，NO₂^—與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰，測定其吸光值，可以計算NO含量。

組成：

試劑二：液體6ml×1瓶，4℃避光保存。(用之前60℃加熱震蕩15min)

自備儀器和用品：

天平、研缽或勻漿器、可見(jiàn)分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。

樣品處理：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。10000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細胞加入1ml提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心15min，取上清置于冰上待測。

3. 體液和培養液等其它液態(tài)樣品：直接測定。

測定步驟和操作表：

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至550nm。

2、 操作表

NO含量計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線(xiàn)回歸方程為：y= 0.016x -0.0103，R²= 0. 9986 

1、組織樣品：

（1）按樣本質(zhì)量計算

NO含量（μmol/g 鮮重）=（ΔA +0.0103）÷0.016×V反總÷（V樣÷V樣總×W）×10^-3

                  = 0.125×（ΔA +0.0103）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算

NO含量（μmol/mg prot）=（ΔA +0.0103）÷0.016×V反總÷（V樣×Cpr）×10^-3

                  = 0.125×（ΔA +0.0103）÷Cpr

2、細胞：

NO含量（μmol/10⁴ cell）=（ΔA +0.0103）÷0.016×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數量）×10^-3

= 0.125×（ΔA +0.0103）÷細胞數量（萬(wàn)個(gè)）

3、其他樣品：

NO含量（μmol/L）=（ΔA +0.0103）÷0.016×V反總÷V樣                   

= 125×（ΔA +0.0103）

V反總：反應總體積，0.2ml；V樣：反應中樣品體積，0.1ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/ml

b. 用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線(xiàn)回歸方程為：y= 0.008x - 0.0103，R²= 0. 9986

1、組織樣品：

（1）按樣本重量計算

NO含量（μmol/g 鮮重）=（ΔA +0.0103）÷0.008×V反總÷（V樣÷V樣總×W）×10^-3

                  = 0.25×（ΔA +0.0103）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算

NO含量（μmol/mg prot）=（ΔA +0.0103）÷0.008×V反總÷（V樣×Cpr）×10^-3

                  = 0.25×（ΔA +0.0103）÷ Cpr

2、細胞：

NO含量（μmol/10⁴ cell）=（ΔA +0.0103）÷0.008×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數量）×10^-3

= 0.25×（ΔA +0.0103）÷細胞數量（萬(wàn)個(gè)）

3、 其他樣品：

NO含量（μmol/L）=（ΔA +0.0103）÷0.008× V反總÷V樣= 250×（ΔA +0.0103）

V反總：反應總體積，0.2ml；V樣：反應中樣品體積，0.1ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/ml