抗性淀粉（RS）是指在人小腸內不能被酶解的淀粉，在大腸部分或完全發(fā)酵。RS是總膳食纖維的組分之一。

   抗性淀粉的測定方法： 樣品使用α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶（AMG）37℃振蕩水浴孵育16小時(shí)，在這期間，通過(guò)兩種酶的聯(lián)合作用，非抗性淀粉被溶解，水解成D-葡萄糖，孵育結束后，加入等體積的乙醇或工業(yè)甲基化酒精（IMS,變性乙醇）終止反應。離心上述溶液，收集上清勿棄，底部殘留絮狀團即為樣品中的RS，用含水的IMS或乙醇（50%v/v）洗滌絮狀團，洗滌后離心，再重復一次洗滌離心，收集離心后獲得的上清，與之前收集的上清混合。小心倒出試管殘留的液體，將絮狀團置于冰水浴中，加入2M KOH溶解，溶解的同時(shí)用磁力攪拌機劇烈攪拌。用醋酸鹽緩沖液將這個(gè)溶液調至中性，用AMG將淀粉定量水解成葡萄糖。D-葡萄糖用葡糖氧化酶/過(guò)氧化物酶試劑（GOPOD）測定，這也是對樣品中RS含量的測定。非抗性淀粉（可溶性淀粉）的測定可通過(guò)集中的上清液并定容至100mL，再用GOPOD測定D-葡萄糖完成。

應用性和精確性

這個(gè)方法需要樣品中RS含量多于2% w/w，如RS含量多于2% w/w，常規標準誤差為±5%，少于2% w/w RS的誤差更高。

試劑盒組成與配制

溶液/懸浮液的制備

試劑一的稀釋：使用移液槍吸取2 mL試劑一溶液用順丁烯二酸鈉緩沖液（100mM pH6.0）稀釋至22mL。

注意：以5 mL為單位分裝后-20℃保存，反復凍融會(huì )影響其穩定性。

溶液配制

1. 順丁烯二酸鈉（馬來(lái)酸鈉）緩沖液(100mM，pH6.0)含2mM二水合CaCl₂和0.02%疊氮化鈉（防腐劑，若沒(méi)有該試劑可不添加）：用1600mL蒸餾水溶解23.2g順丁烯二酸鈉，接著(zhù)用NaOH調節pH至6.0，加入0.6g二水合CaCl₂和0.4g疊氮化鈉，混合并溶解，定容至2L。

2. 醋酸鈉緩沖液（1.2M，PH3.8）：將69.6mL的冰醋酸加至800 mL的蒸餾水中，用NaOH調節pH至pH3.8，用蒸餾水定容至1L。

3. 醋酸鈉緩沖液（100mM，PH4.5）：將5.8mL的冰醋酸加至900 mL的蒸餾水中，用NaOH調節pH至4.5，用蒸餾水定容至1L。

4. 氫氧化鉀溶液（2M）：將112.2g KOH加至900 mL的去離子水中，攪拌溶解。定容至1L，密封保存。

5. 50%乙醇：將500mL乙醇（95%v/v或者99%v/v）加入500mL的水中，密封保存。

儀器設備

1. 離心式粉碎機，帶有齒輪轉子和1.0mm篩子，或類(lèi)似的裝置；小型樣品可選擇磨碎機替代。

2. 絞肉機-手動(dòng)或電動(dòng)的，裝有4.5mm篩

3. 臺式離心機

4. 振蕩水浴器，可設定為每分鐘100次直線(xiàn)運動(dòng)（振蕩速度為每分鐘200里程），振蕩距離35mm,37℃

5. 水浴鍋

6. 渦旋儀

7. 磁力攪拌器

8. 磁力攪拌棒-5×15mm

9. pH計

10. 計時(shí)器

11. 分析天平（精確到0.1mg）

12. 分光光度計-能夠設定510nm（10mm路徑長(cháng)度）

13. 100μL移液器及一次性槍頭

14. 連續分配器配有50mL管嘴，能夠移取2.0mL，3.0mL和4.0mL

15. 溫度計-能夠讀取37+0.1℃和50+0.1℃

16. 容量瓶-100mL，200mL，500mL，1L，2L

樣品制備

用磨碎機研磨大約50g谷物樣品或凍干植物或食品，使樣品粉末可過(guò)1.0mm篩，轉移所有的材料至廣口瓶，顛倒振蕩混勻。工業(yè)淀粉一般不用研磨，用絞肉機粉碎鮮樣（如罐裝的豆子，香蕉，土豆），過(guò)4.5mm篩，測定干樣中的含水量，根據AOAC法925.10，凍干后烘爐干燥測定鮮樣中的含水量。

分析方法

（a）水解和溶液化非抗性淀粉

1. 準確稱(chēng)取100mg樣品后直接倒入15mL離心管中，樣品應盡量集中在底部，向每個(gè)離心管中加入4.0 mL試劑二；

注意：對于濕樣，樣品大概為0.5g（準確稱(chēng)重），這些材料的含水量通常為60-80%

2. 蓋緊離心管管蓋，進(jìn)行渦旋混勻，之后放入振蕩水浴器中37℃孵育16h；

3. 把離心管從水浴鍋中拿出，用紙巾擦掉多余的水，打開(kāi)蓋子放置在渦旋儀上輕輕渦旋同時(shí)加入4.0mL無(wú)水乙醇混勻；

4. 1500xg離心10min，小心倒出上清并保留（后續實(shí)驗及計算需要），向沉淀中加入2mL 50%乙醇，用渦旋儀渦旋混勻，再加入6mL 50%乙醇，渦旋混勻；

5. 1500xg離心10min，小心倒出上清并保留（后續實(shí)驗及計算需要），重復上述重懸浮步驟；

6. 1500xg離心10min，小心倒出上清并保留（后續實(shí)驗及計算需要），翻轉試管，用紙巾吸除多余的液體。

（b）測定抗性淀粉含量

1. 將離心管放入冰上進(jìn)行冰浴，向每個(gè)離心管中加入2 mL 2M的KOH再使用磁力攪拌棒攪勻，用磁力攪拌棒在冰浴狀態(tài)下攪拌20min，使抗性淀粉得到充分溶解； 

注意：

（1）不要使用渦旋儀混勻，會(huì )導致淀粉乳化。

（2）確保邊加入KOH溶液邊攪拌，避免形成難溶的淀粉塊。

2. 向每個(gè)離心管中加入8 mL醋酸鈉緩沖液（1.2M，pH3.8），使用磁力攪拌機攪拌，混合均勻后加入0.1mL試劑一，混勻，放入水浴鍋中50℃水浴30min，期間用渦旋儀混勻3~5次；

3. 對于抗性淀粉含量>10%的樣品，用水洗瓶定量轉移試管里的樣品至100mL容量瓶并用蒸餾水定容至100mL，混勻后，1500xg離心10min（對于抗性淀粉含量<10%的樣品，直接1500xg離心10min）；取上清液，即為抗性淀粉上清液；

4. 吸取步驟4抗性淀粉上清液0.1mL至5mL EP管中，一式兩份，分別加入3.0mL的試劑四溶液，50℃孵育20min;

5. 測量每一個(gè)溶液在510nm處相對于空白試劑的吸光度值；

注意：反應結束后，放冷5min內測完結果

6. 計算抗性淀粉的含量。

（c）計算可溶性的非抗性淀粉含量

1. 將流程（a）中步驟4~6的上清收集到容量瓶中，用醋酸鈉緩沖液（100mM，pH4.5）定容至100mL，混勻作為非抗性淀粉待測液；

2. 使用移液槍吸取0.1 mL非抗性淀粉待測液轉移到5mL EP管中（一式兩份）并加入10μL稀釋試劑一混合均勻，50℃孵育20min，之后加入3.0 mL試劑四溶液混合均勻，50℃孵育20min；

3. 計算在510nm下相對于空白試劑的吸光度值。

注意：反應結束后，放冷5min內測完結果；

4. 計算非抗性淀粉的含量。

（d）制備空白試劑和標準品溶液

1、準備空白試劑：將 0.1ml 的醋酸鈉緩沖液（100mM，pH4.5）和 3.0ml 的試劑四溶液混勻；

2、制備標準品溶液（一式四份）：將 0.1ml 標準品和 3.0ml 的 試劑四溶液混勻；

3、統一放入50℃孵育20min，記錄在510nm下的吸光度值。