簡(jiǎn)介

淀粉是人類(lèi)飲食中主要的能量來(lái)源，它在多種食物中富含，如谷類(lèi)、豆類(lèi)、根莖類(lèi)蔬菜和水果。淀粉在許多加工類(lèi)食品和動(dòng)物飼料中也占有相當大的比例，并以天然或化學(xué)改性的形式在工業(yè)上得到廣泛應用。淀粉測定方法分為酸水解法和酶分析法，其中酸水解只能應用干純淀粉樣品。針對不同的樣品，酶分析方法在前處理步驟上有所不同。經(jīng)典的AACC76-11法采用淀粉在高壓蒸汽滅菌鍋中及含水的條件下凝膠化，并用淀粉葡糖苷酶將淀粉轉化為葡萄糖，再測定葡萄糖含量，采用AACC76-11法會(huì )導致許多樣品和材料中包括高直鏈淀粉、玉米淀粉和谷物制品淀粉含量檢測結果偏低。近來(lái)，我們對檢測方法進(jìn)行了改進(jìn)，使耐熱α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶可以在相同的pH（pH=5.0）下進(jìn)行孵育，這樣簡(jiǎn)化了測定步驟，并將麥芽酮糖生成的可能性降到最低。淀粉總量試劑盒可測定大部分食品、飼料、植物和谷物制品(天然或加工過(guò)的)，對于大部分樣品（如小麥粉）中的淀粉在孵育中（大約100℃并加入耐熱α-淀粉酶）會(huì )完全溶解；對于含有大量抗性淀粉的樣品（如高直鏈玉米淀粉）需用1.7M NaOH或熱DMSO進(jìn)行預溶解；而含有可溶性淀粉或麥芽糊精的樣品，不需要用耐熱-淀粉酶處理。

產(chǎn)品性能

特異性:可用于測定-葡聚糖(包括淀粉、糖原、植物糖原和非抗性麥芽糊精)

靈敏度:最小吸光度差異為0.010吸光度單位。這相當于當樣品質(zhì)量為100mg時(shí)，總淀粉含量為0.09mg。

檢測限:吸光度差異為0.020吸光度單位。這相當于樣品質(zhì)量為100mg時(shí)，總淀粉含量為0.18mg。

檢測范圍:在5-100 μg D-葡萄糖范圍內呈線(xiàn)性關(guān)系。重復檢測同一樣品溶液其吸光度值會(huì )有0.005-0.010吸光度單位的差異，如果樣品經(jīng)過(guò)稀釋?zhuān)嬎憬Y果時(shí)需要乘以相應的稀釋系數（F）。

檢測原理

（1）耐熱a-淀粉酶將淀粉水解為可溶性的、有支鏈的、無(wú)支鏈的麥芽糊精

 （2）含大量抗性淀粉的樣品可以加入2 mol/L KOH混合均勻，在4℃下使抗性淀粉預溶解，然后用醋酸鈉緩沖液中和，最后用α-淀粉酶處理。也可以在100℃下，用DMSO溶解，再加入α-淀粉酶處理生成麥芽糊精。

（3）淀粉葡糖苷酶(AMG)將麥芽糊精定量水解成D-葡萄糖

（4）D-葡萄糖被葡萄糖氧化酶氧化成D-葡萄糖酸鹽，并釋放等摩爾的H₂O₂。再用過(guò)氧化物酶催化H₂O₂反應，產(chǎn)生的昆亞胺染料含量用比色法測定。

（5）過(guò)氧化氫被過(guò)氧化物酶催化生成水和氧氣，同時(shí)對羥基苯甲酸和4-氨基安替比林被氧化生成醌亞胺；這一過(guò)程可以通過(guò)比色反應進(jìn)行測定。

如果樣品中含高水平的D-葡萄糖和麥芽糊精，可在測定前用80%乙醇處理。一個(gè)樣品的檢測可以在70分鐘內完成。

保存條件

未配制前在規定存儲條件下6個(gè)月內有效，配制使用后在規定存儲條件下3個(gè)月內有效（各組分詳細儲存條件見(jiàn)瓶身）。

試劑盒組成與配置

1. 所需的儀器和用品：

2. 可見(jiàn)分光光度計/酶標儀、10mm玻璃比色皿/96孔板、水浴鍋、可調式移液器、離心機、磁力攪拌器、渦旋儀等

2. 需配試劑：

a、 醋酸鈉緩沖液（100 mM，pH 5.0）含CaCl₂（5 mM）：在900 ml蒸餾水中加入5.8 ml冰醋酸，后加入0.74 g二水合CaCl₂并溶解，使用NaOH溶液將pH值調節到5.0，使用蒸餾水定容至1L，并在4°C下儲存緩沖液。

b、 醋酸鈉緩沖液（200mM，pH 4.5）含CaCl₂（5 mM）：向900 ml蒸餾水中添加11.6 ml冰醋酸，后加入0.74 g二水合CaCl₂并溶解，使用氫氧化鈉溶液將pH值調整為4.5，使用蒸餾水定容至1L，并在4°C下儲存緩沖液。

c、 醋酸鈉緩沖液（600 mM，pH 3.8）含CaCl₂（5 mM）：向1600 ml蒸餾水中添加69.6 ml冰醋酸，后加入1.48 g二水合CaCl₂并溶解，使用氫氧化鈉溶液將pH值調節至3.8，使用蒸餾水定容至2L，并在4°C下儲存緩沖液。

d、 NaOH溶液（1.7 M）：稱(chēng)取68g氫氧化鈉，加入900ml去離子水，攪拌溶解，將容量調整為1L并儲存在密封容器中，室溫保存。

e、 MOPS緩沖液（50mM，pH7.0）含CaCl₂（5mM）、疊氮化鈉（0.02%）：取11.55g MOPS（鈉鹽, Sigma cat. M-9381）加入900ml蒸餾水溶解, 后加入二水合CaCl₂ 0.74g，用HCl調節pH=7.0， 稱(chēng)取疊氮化鈉0.2g 完全溶解, 然后調整到1L，并在4℃保存。

注：在調整pH值之前，不得添加疊氮化鈉，疊氮化鈉酸化會(huì )釋放出有毒氣體。

淀粉含量測定

（a） 不含抗性淀粉的樣品總淀粉含量的測定

1. 碾磨谷物、植物或食品，使用0.5mm孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行分篩；

2. 準確稱(chēng)取100 mg待測樣品，一式兩份（一份作為空白管）放入50ml離心管中；

3. 向兩支離心管中分別加入10ml緩沖液a：醋酸鈉緩沖液（100mM，pH 5.0）含CaCl2（5mM），使用渦旋移混勻5s；

4. 向其中一個(gè)離心管（樣品管）中添加0.1 ml未稀釋的試劑一，向第二根離心管（空白管）中加入0.1ml緩沖液a：醋酸鈉緩沖液（100mM，pH 5.0）含CaCl₂（5mM），將管中液體混合均勻；

5. 輕輕旋上蓋子，將離心管轉移到100℃沸水浴中處理2min后，擰緊瓶蓋；在渦旋儀上用力混合離心管內容物，過(guò)5min后，再次將離心管內容物渦旋5s；然后將試管放回100℃沸水浴中15min，從沸水浴中取出試管，在渦旋儀上劇烈渦旋5s；最后將離心管放在50°C的水浴中平衡管內溫度至少5min；

6. 向樣品管中添加0.1 ml未稀釋試劑二，渦旋3s，向空白管中添加0.1 ml緩沖液a：醋酸鈉緩沖液（100 mM pH 5.0）含CaCl₂（5 mM）；輕輕混勻后在50°C下處理樣品30min；

7. 從水浴鍋中取出離心管，室溫冷卻后將管子倒置幾次，使管蓋內側的冷凝水與管內的液體混合；

8. 從離心管（樣品管和空白管）中分別取出2.0 ml溶液轉移到5ml EP管中，以13000 rpm的轉速離心EP管5min并靜置5min；吸取1.0 ml上清液轉移到新的15ml離心管中，加入4 ml緩沖液a：醋酸鈉緩沖液（100 mM，pH 5.0）含CaCl₂（5 mM），并將管內液體混合均勻；

9. 分別從15ml離心管（樣品管和空白管）中吸取溶液0.05 ml到新的5ml EP管中；接著(zhù)向管中加入1.5 ml 試劑四，輕輕混勻，在50°C下培養20min；反應結束后吸取200ul液體轉移至96孔板中，于510nm處讀數；

同時(shí)孵化：

標準管：0.05 ml葡萄糖標準溶液（1.0 mg/ml）加1.5 ml試劑四，一式四份；

空白管：0.05 ml 緩沖液a：乙酸鈉緩沖液（100 mM，pH 5.0）含CaCl₂（5 mM）和1.5 ml試劑四，一式兩份。

與樣品管和空白管同時(shí)在50°C下培養20min；反應結束后吸取200ul液體轉移至96孔板中，于510nm處讀數；

10. 計算淀粉含量。

注：對于本提取方案，最終提取體積（EV）=10.2   稀釋度（D）=1、5或11

注1：如果樣品的吸光度值小于0.05，步驟8中離心后吸取上清，無(wú)需再添加緩沖液進(jìn)行稀釋；如果吸光度值大于0.60，吸取離心后上清，可以加入10ml緩沖液a進(jìn)行稀釋?zhuān)?span>稀釋度（D）=1、5或11）。

注2：當分析含有約20-30%淀粉的草和青貯飼料等纖維樣品時(shí)，使用攪拌機研磨樣品，研磨約60秒（直到樣品均勻為止）。步驟2中稱(chēng)取樣品增加至500 mg進(jìn)行后續實(shí)驗；步驟5中在100°C下沸水浴的處理時(shí)間延長(cháng)至60min；步驟8中需要對樣品稀釋20倍再進(jìn)行后續檢測（稀釋度（D）=20）。

（b） 含抗性淀粉樣品總淀粉含量的測定

1. 碾磨谷物、植物或食品，使用0.5mm孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行分篩；

2. 準確稱(chēng)取100mg待測樣品，一式兩份（一份作為空白管）放入50ml離心管中；

3. 向離心管中加入0.2ml 80%乙醇混合均勻，使樣品在離心管中均勻分散，該步驟非常重要；

4. 向離心管中添加2ml 1.7M NaOH溶液，并在渦旋儀上渦旋混勻15s；之后將離心管放在冰水浴中處理15min，在此期間需要間歇性在渦旋儀上渦旋3-5次,確保樣品中沒(méi)有結塊；

5. 向離心管中添加8 ml緩沖液c：醋酸鈉緩沖液（600 mM，pH 3.8）含CaCl₂（5 mM）,在渦旋儀上渦旋混勻；

6. 立即向樣品管中添加0.1 ml未稀釋的試劑一，然后再添加0.1 ml試劑二。向第二根離心管（空白管）中添加0.2 ml緩沖液a：醋酸鈉緩沖液（100 mM，pH 5.0）含CaCl₂（5 mM），旋緊兩個(gè)離心管管蓋并渦旋混勻3s并將離心管放置在50°C下培養30min；

7. 從水浴鍋中取出離心管，室溫冷卻后將管子倒置幾次，使管蓋內側的冷凝水與管內的液體混合；

8. 從離心管（樣品管和空白管）中分別取出2.0 ml溶液轉移到5ml EP管中，以13000 rpm的轉速離心EP管5min并靜置5min；吸取1.0 ml上清液轉移到新的15ml離心管中，加入4 ml緩沖液a：醋酸鈉緩沖液（100 mM，pH 5.0）含CaCl₂（5 mM），并將管內液體混合均勻；

9. 分別從15ml離心管（樣品管和空白管）中吸取溶液0.05 ml到新的5ml EP管中；接著(zhù)向管中加入1.5ml 試劑四，輕輕混勻，在50°C下培養20min；反應結束后吸取200ul液體轉移至96孔板中，于510nm處讀數；

同時(shí)孵化：

標準管：0.05 ml葡萄糖標準溶液（1.0 mg/ml）加1.5ml試劑四，一式四份。

空白管：0.05 ml緩沖液a：乙酸鈉緩沖液（100 mM，pH 5.0）加CaCl₂（5 mM）和1.5 ml試劑四，一式兩份。

與樣品管和空白管同時(shí)在50°C下培養20min；反應結束后吸取200ul液體轉移至96孔板中，于510nm處讀數；

10. 計算淀粉含量。

注：對于本提取方案，最終提取體積（EV）=10.4   稀釋度（D）=1、5或11

注1：如果樣品的吸光度值小于0.050，步驟8中離心后吸取上清，無(wú)需再添加緩沖液進(jìn)行稀釋；如果吸光度值大于0.60，吸取離心后上清，可以加入10ml緩沖液a進(jìn)行稀釋?zhuān)?span>稀釋度（D）=1、5或11）。

（c） 不含抗性淀粉、D-葡萄糖和/或麥芽糊精的樣品總淀粉含量的測定

1. 碾磨谷物、植物或食品，使用0.5mm孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行分篩；

2. 準確稱(chēng)取100 mg待測樣品，一式兩份（一份作為空白管）放入50ml離心管中；

3. 向離心管中加入0.2ml 80%乙醇混合均勻，使樣品在離心管中均勻分散，該步驟非常重要；

4. 向離心管中添加3 ml稀釋后的試劑一（將試劑一用MOPS緩沖液（50 mM，pH 7.0）含CaCl₂（5 mM）稀釋30倍），將離心管放入100℃沸水浴中孵育6min，在此期間需要間歇性在渦旋儀上渦旋3-5次充分混勻；

5. 將離心管轉入50°C的水浴鍋中，溫育5min；之后加入4 ml緩沖液b：醋酸鈉緩沖液（200 mM，pH 4.5）含CaCl₂（5 mM），然后加入0.1ml試劑二，在渦旋儀上渦旋混勻，并在50°C下培養30min；

6. 將離心管中的全部?jì)热菸镛D移到100 ml容量瓶中，用緩沖液b：醋酸鈉緩沖液（200 mM，pH 4.5）含CaCl₂（5 mM）定容至100ml，并將瓶中液體混合；

7. 從容量瓶（樣品管和空白管）中分別取出2.0 ml溶液轉移到5ml EP管中，以13000 rpm的轉速離心EP管5min并靜置5min； 

8. 分別從5ml EP管（樣品管和空白管）中吸取溶液0.05 ml到新的5ml EP管中；接著(zhù)向管中加入1.5 ml 試劑四，輕輕混勻，在50°C下培養20min；反應結束后吸取200ul液體轉移至96孔板中，于510nm處讀數；

同時(shí)孵化：

標準管：0.05 ml葡萄糖標準溶液（1.0 mg/ml）加1.5 ml試劑四，一式四份。

空白管：0.05 ml緩沖液a：乙酸鈉緩沖液（100 mM，pH 5.0）加CaCl₂（5 mM）和1.5ml試劑四，一式兩份。

與樣品管和空白管同時(shí)在50°C下培養20min；反應結束后吸取200ul液體轉移至96孔板中，于510nm處讀數；

9. 計算淀粉含量。

注：對于本提取方案，最終提取體積（EV）=100  稀釋度（D）=1

（d） 含有抗性淀粉但不含D-葡萄糖和/或麥芽糊精的樣品總淀粉含量的測定

1. 碾磨谷物、植物或食品，使用0.5mm孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行分篩；

2. 準確稱(chēng)取100 mg待測樣品，一式兩份（一份作為空白管）放入50ml離心管中；

3. 向離心管中加入0.2ml 80%乙醇混合均勻，使樣品在離心管中均勻分散，該步驟非常重要；

4. 向離心管中加入2ml二甲基亞砜（DMSO），并在渦旋儀上渦旋混勻，將離心管放入100℃沸水浴中處理5min，在此期間需要間歇性在渦旋儀上渦旋3-5次充分混勻；

5. 向離心管中添加3 ml稀釋后的試劑一（將試劑一用MOPS緩沖液（50 mM，pH 7.0）含CaCl₂（5 mM）稀釋30倍），將離心管放入100℃沸水浴中孵育6min，在此期間需要間歇性在渦旋儀上渦旋3-5次充分混勻；

6. 將離心管轉入50°C的水浴鍋中，溫育5min；之后加入4 ml緩沖液b：醋酸鈉緩沖液（200 mM，pH 4.5）含CaCl₂（5 mM），然后加入0.1ml試劑二，在渦旋儀上渦旋混勻，并在50°C下培養30min；

7. 將離心管中的全部?jì)热菸镛D移到100 ml容量瓶中，用緩沖液b：醋酸鈉緩沖液（200 mM，pH 4.5）含CaCl₂（5 mM）定容至100ml，并將瓶中液體混合；

8. 從容量瓶（樣品管和空白管）中分別取出2.0 ml溶液轉移到5ml EP管中，以13000 rpm的轉速離心EP管5min并靜置5min； 

9. 分別從5ml EP管（樣品管和空白管）中吸取溶液0.05 ml到新的5ml EP管中；接著(zhù)向管中加入1.5 ml 試劑四，輕輕混勻，在50°C下培養20min；反應結束后吸取200ul液體轉移至96孔板中，于510nm處讀數；

同時(shí)孵化：

標準管：0.05 ml葡萄糖標準溶液（1.0 mg/ml）加1.5 ml試劑四，一式四份。

空白管：0.05 ml緩沖液a：乙酸鈉緩沖液（100 mM，pH 5.0）加CaCl₂（5 mM）和1.5ml試劑四，一式兩份。

與樣品管和空白管同時(shí)在50°C下培養20min；反應結束后吸取200ul液體轉移至96孔板中，于510nm處讀數；

10. 計算淀粉含量。

注：對于本提取方案，最終提取體積（EV）=100  稀釋度（D）=1

注1：二甲基亞砜作為皮膚刺激物，因此應謹慎使用。它通過(guò)皮膚吸收，會(huì )對皮膚和眼睛造成刺激。使用時(shí)穿戴防護品并避免濺出溶劑，盡可能在通風(fēng)柜中使用。

（e） 含有D-葡萄糖和/或麥芽糊精的樣品總淀粉含量的測定

用乙醇洗滌去除D-葡萄糖和麥芽糊精

[注：麥芽糊精在乙醇水溶液中的溶解度主要取決于麥芽糊精的DP（聚合度）范圍、最終乙醇濃度和溶液溫度]。

1. 碾磨谷物、植物或食品，使用0.5mm孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行分篩；

2. 準確稱(chēng)取100 mg待測樣品，一式兩份（一份作為空白管）放入50ml離心管中；

3. 向50ml離心管中加入5.0 ml 80%乙醇并在80-85°C下培養5分鐘，使用渦旋儀渦旋混勻溶液，并補加5 ml 80%乙醇；

4. 在臺式離心機上，以3250xg離心10min，去除上清，保留沉淀；

5. 向離心管中加入5 ml 80%乙醇中重懸沉淀，并使用渦旋儀渦旋混勻，再加入5ml 80%乙醇，倒置混合，按照步驟4再次離心，并小心地倒出上清液；

6. 向離心管中添加3 ml稀釋后的試劑一（將試劑一用MOPS緩沖液（50 mM，pH 7.0）含CaCl₂（5 mM）稀釋30倍），將離心管放入100℃沸水浴中孵育6min，在此期間需要間歇性在渦旋儀上渦旋3-5次充分混勻；

7. 將離心管轉入50°C的水浴鍋中，溫育5min；之后加入4 ml緩沖液b：醋酸鈉緩沖液（200 mM，pH 4.5）含CaCl₂（5 mM），然后加入0.1ml試劑二，在渦旋儀上渦旋混勻，并在50°C下培養30min；

8. 將離心管中的全部?jì)热菸镛D移到100 ml容量瓶中，用緩沖液b：醋酸鈉緩沖液（200 mM，pH 4.5）含CaCl₂（5 mM）定容至100ml，并將瓶中液體混合；

8. 從容量瓶（樣品管和空白管）中分別取出2.0 ml溶液轉移到5ml EP管中，以13000 rpm的轉速離心EP管5min并靜置5min； 

9. 分別從5ml EP管（樣品管和空白管）中吸取溶液0.05 ml到新的5ml EP管中；接著(zhù)向管中加入1.5ml 試劑四，輕輕混勻，在50°C下培養20min；反應結束后吸取200ul液體轉移至96孔板中，于510nm處讀數；

同時(shí)孵化：

標準管：0.05 ml葡萄糖標準溶液（1.0 mg/ml）加1.5 ml試劑四，一式四份。

空白管：0.05 ml緩沖液a：乙酸鈉緩沖液（100 mM，pH 5.0）加CaCl₂（5 mM）和1.5ml試劑四，一式兩份。

與樣品管和空白管同時(shí)在50°C下培養20min；反應結束后吸取200ul液體轉移至96孔板中，于510nm處讀數；

10. 計算淀粉含量。

注：對于本提取方案，最終提取體積（EV）=100  稀釋度（D）=1

（f） 淀粉以可溶性或懸浮形式存在的樣品中總淀粉含量的測定

1. 將液體樣品適量轉入50ml離心管中通過(guò)渦旋儀混勻，徹底混合樣品。可以加熱或使用均質(zhì)儀以獲得樣品的均勻懸浮液；

2. 使用移液器吸取100mg樣品轉入新的50ml離心管中，一式兩份（一份作為空白管）；

后續步驟于提取方案（a）中步驟3~步驟10相同。

        注：對于本提取方案，稀釋樣品體積（DSV）=10.2 ml，稀釋度（D）=1、5或11，樣品體積（SV）=5ml

（g） 懸浮態(tài)含抗性淀粉樣品中總淀粉含量的測定

1. 將液體樣品適量轉入50ml離心管中通過(guò)渦旋儀混勻，徹底混合樣品。可以加熱或使用均質(zhì)儀以獲得樣品的均勻懸浮液；

2. 使用移液器吸取100mg樣品轉入新的50ml離心管中，一式兩份（一份作為空白管）；

后續步驟于提取方案（b）中步驟3~步驟10相同。

注：對于本提取方案，稀釋樣品體積（DSV）=12.2 ml，稀釋度（D）=1、5或11，樣品體積（SV）=2 ml

計算：

1.固體樣品的計算（mg）：

淀粉含量，% = ΔA × F×（EV/0.1）×（1/1000）×D×（100/W）×（162/180）

=ΔA ×F ×EV ×（D/W) x 0.90

其中：

ΔA=相當于試劑空白讀取的吸光光度值(反應) ；       

F =吸光光度值轉換為葡萄糖重量(ug)的因子（100ug D-葡萄糖的重量/100μg D-葡萄糖的吸光光度值）；

EV=最終體積樣品提取量:流程（a）為10.2 ml，流程（b）為10.4ml，流程（c）和（d）為100ml;                  0.1=用于檢測的樣品體積；      

D=樣品溶液的進(jìn)一步稀釋倍數（未稀釋、稀釋5倍或稀釋11倍）；    

（1/1000）=從ug到mg的轉換；

（100/W）=一定重量干粉中淀粉含量的百分比值；

（162/180）=淀粉中游離的D-葡萄糖轉化為D-葡萄糖酐的因子；               

淀粉含量，%(干重)=淀粉含量，%(上述算法結果) ×100/（100-含水量，%)

2.液體樣品的計算（mg/100 ml）：

淀粉  = ΔA×F ×（DSV/SV）×（100/0.1）×（1/1000）×（162/180）×D

= ΔA × F×DSV/SV×0.9

ΔA=相當于試劑空白讀取的吸光光度值(反應) ；       

F =吸光光度值轉換為葡萄糖重量(ug)的因子（100μg D-葡萄糖的重量/100μg D-葡萄糖的吸光光度值）；

DSV=稀釋樣品體積（即加入醋酸鹽緩沖液、α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶后的樣品體積）；

SV=分析用樣品的體積：流程（f）為5 ml，流程（g）為2 ml；  

100=換算成100ml樣品體積；

0.1=用于檢測的樣品體積；           

（1/1000）=從μg到mg的轉換；

（162/180）=淀粉中游離的D-葡萄糖轉化為D-葡萄糖酐的的因子；               

D=樣品溶液的進(jìn)一步稀釋?zhuān)ㄎ聪♂?/span>、稀釋5倍或稀釋11倍）     

淀粉（g/100g樣品）=mg/100ml×100/樣品干重（mg/ml)