PCR革新技術(shù)-英國TwistDx Inc公司開(kāi)發(fā)恒溫擴增RPA 

        自PCR技術(shù)誕生以來(lái)已經(jīng)有三十年了。從經(jīng)典PCR、實(shí)時(shí)定量PCR再到現在的數字PCR，這一技術(shù)在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。近年來(lái)，等溫擴增技術(shù)的興起無(wú)疑是對PCR的巨大挑戰。
        等溫擴增技術(shù)的基因快速診斷方法,涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域,具體是用體外生物檢測試劑快速檢測病原微生物的一種技術(shù)。
包括如下步驟:一、對被檢樣品進(jìn)行預處理;二、包括目標靶基因數據庫的建立;生物信息學(xué)的分析比較;基因組多態(tài)性的分型處理和簡(jiǎn)并堿基的運用,獲得各種靶基因的特異性引物兩對,分別與靶基因中的六個(gè)獨立區域序列特異性匹配;三、進(jìn)行等溫擴增反應;四、分析判斷結果。該方法的優(yōu)點(diǎn):不需特殊試劑與設備;高特異性;.靈敏度高;鑒定簡(jiǎn)便;用途廣: 可用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域的質(zhì)量控制和環(huán)境、水質(zhì)等監測;用于醫學(xué)臨床診斷,用于代謝性疾病和遺傳疾病的基因診斷。
         英國TwistDx Inc公司開(kāi)發(fā)的重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)--被稱(chēng)為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)，目前全球最新的等溫擴增檢測技術(shù)。以此為基礎的TwistAmp? 核酸擴增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測。該技術(shù)對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物防御、農業(yè)等領(lǐng)域。
         常規PCR必須經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸三個(gè)步驟，而PCR儀本質(zhì)上就是一個(gè)控制溫度升降的設備。RPA反應的最適溫度在37°C - 42°C之間，無(wú)需變性，在常溫下即可進(jìn)行。這無(wú)疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要溫控設備，RPA可以真正實(shí)現便攜式的快速核酸檢測。
        據介紹，RPA檢測的靈敏度很高，能夠將痕量的核酸(尤其是DNA)模板擴增到可以檢出的水平，從單個(gè)模板分子得到大約1012擴增產(chǎn)物。而且RPA還用不著(zhù)復雜的樣品處理，適用于無(wú)法提取核酸的實(shí)地檢測。
        RPA既可以擴增DNA也可以擴增RNA，還省去了額外的cDNA合成步驟。你不僅可以對擴增產(chǎn)物進(jìn)行終點(diǎn)檢測，還可以對擴增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監控，甚至可以通過(guò)試紙條(側流層析試紙條LFD)讀取結果。
        目前，TwistAmp? 試劑盒的擴增子長(cháng)度在500bp以?xún)?。不過(guò)，經(jīng)過(guò)特別優(yōu)化的RPA擴增，也可以生成更長(cháng)的擴增產(chǎn)物，或者減慢擴增速度(便于定量)，甚至在更低的溫度下進(jìn)行反應。
        RPA技術(shù)的基本原理
        RPA技術(shù)主要依賴(lài)于三種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應溫度在37°C左右。
        重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì )發(fā)生鏈交換反應形成并啟動(dòng)DNA合成，對模板上的目標區域進(jìn)行指數式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由兩個(gè)相對的引物起始一個(gè)合成事件。整個(gè)過(guò)程進(jìn)行得非?？?，一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產(chǎn)物。RPA擴增的基礎體系(TwistAmp? Basic)含有DNA擴增所需的所有試劑，我們只要準備好引物和模板就行。擴增結果可以通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行終點(diǎn)檢測，產(chǎn)物純化后可用于下游研究。
在這個(gè)基礎體系中添入不同的酶和探針，就可以實(shí)現多樣化的RPA應用。舉例來(lái)說(shuō)，TwistAmp? Basic RT添加了逆轉錄酶，可以對RNA模板進(jìn)行一步法擴增。TwistAmp? exo結合了專(zhuān)利的exo探針技術(shù)和核酸外切酶III，能實(shí)現數據的實(shí)時(shí)讀取，就像熒光定量PCR一樣。不過(guò)反應終點(diǎn)的擴增子總量有所減少，適合獲得強熒光信號進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，不適合終點(diǎn)檢測(比如跑膠)。將exo探針技術(shù)、核酸外切酶III和逆轉錄酶結合起來(lái)的 TwistAmp? exo RT，可以一步實(shí)現RNA模板的實(shí)時(shí)擴增。
        TwistAmp? fpg是一個(gè)添加了核酶fpg的實(shí)時(shí)報告體系。fpg探針技術(shù)的熒光累積比較慢，但終點(diǎn)的擴增子產(chǎn)量不會(huì )減少，因此也能支持終點(diǎn)分析。TwistAmp? nfo加入了核酶nfo，可以用“三明治法”進(jìn)行終點(diǎn)檢測，比如測流層析試紙條LFD。
除此之外，RPA擴增還可以很簡(jiǎn)單的實(shí)現多重化。只需要增加引物/探針就可以一次性檢測多個(gè)擴增產(chǎn)物。
        RPA分析的關(guān)鍵在于擴增引物和探針的設計。PCR引物多半是不適用的，因為RPA引物比一般PCR引物長(cháng)，通常需要達到30-38個(gè)堿基。引物過(guò)短會(huì )降低重組率，影響擴增速度和檢測靈敏度。
        在設計RPA引物時(shí)，變性溫度不再是影響擴增引物的關(guān)鍵因素。RPA的引物和探針設計不像傳統PCR那樣成熟，用戶(hù)需要自己摸條件進(jìn)行優(yōu)化。雖然還沒(méi)有設計軟件可以使用，不過(guò)TwistDx Inc公司在自己的網(wǎng)站上提供了相應的篩選指南。
需要注意的是，目前的TwistAmp? 擴增試劑盒都沒(méi)提供RNase抑制劑。另外，受目前的生產(chǎn)方法所限，RPA反應不適合用于E. coli標準實(shí)驗室菌株的擴增。

RPA 便攜、等溫，可替代 PCR ，非常適合用于分子檢測試劑、動(dòng)物、食品安全、生物防御和農業(yè)中。
速度—— 檢測時(shí)間 15 分鐘以?xún)龋?br /> 敏感度—— 單分子檢測，不需要  thermocyler ；
簡(jiǎn)單—— 穩定的凍干試劑，幾乎沒(méi)有硬件要求的可靠等溫技術(shù)。
1.TwistAmp Basic  試劑盒（ 96 次）
2.TwistAmp exo  試劑盒（ 96 次）
3.TwistA m p nfo  試劑盒（ 96 次）
4.TwistAmp Basic  試劑盒（ 96 次）
5.TwistAmp exo RT  試劑盒（ 96 次）
6.TwistAmp Basic RT  試劑盒（ 96 次）
7.TwistFlow Salmonella 沙門(mén)氏菌試劑盒（ 24 次）檢測是否含有沙門(mén)氏菌的試劑盒與  Milenia Hybridtech 2 橫向流試劑條配套使用）
8.TwistGlow Salmonella 沙門(mén)氏菌試劑盒（ 96 次）檢測是否含有沙門(mén)氏菌的試劑盒
9.TwistFlow Red Snappe 紅魚(yú)試劑盒（ 8 次） 檢測是否為紅 魚(yú)的試劑盒
10.TwistAmp exo +ListeriaM 李斯特菌試劑盒（ 96 次）檢測是否含有李斯特菌的試劑盒
11.TwistAmp exo + Campylobacter 彎曲菌試劑盒（ 96 次）檢測是否含有彎曲菌的試劑盒
12.Milenia Hybridtech 1 側向流試劑條
13.Milenia Hybridtech 2 側向流試劑條
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