中文摘要

       當前新型冠狀病毒肺炎 （COVID-19） 疫情仍在全球大流行，確診病例和死亡人數仍不斷攀升，如何有效控制病毒的傳播，降低傳染率和死亡率是目前全人類(lèi)亟待解決的問(wèn)題。一方面需要快速、可靠、經(jīng)濟的檢測方法及時(shí)發(fā)現新型冠狀病毒 （SARS-CoV-2） 感染者，另一方面需要尋找新穎、有效的COVID-19治療及預防策略。各種基于CRISPR-Cas系統的新一代基因編輯技術(shù)以其快速、便攜、經(jīng)濟、高效的特點(diǎn)為COVID-19快速分子診斷提供了解決方案。CRISPR-Cas系統具有可準確識別并降解SARS-CoV-2核酸的特點(diǎn)，為研發(fā)針對COVID-19的新型治療及預防手段提供了一種潛在的技術(shù)方案。此文對目前COVID-19診斷及治療現狀進(jìn)行了分析，對基于CRISPR-Cas系統的COVID-19分子診斷、治療及預防策略研究及其新進(jìn)展進(jìn)行了簡(jiǎn)述。

正文

       當前，由新型冠狀病毒 （severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2） 引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎 （COVID-19） 疫情仍在全球180多個(gè)國家和地區持續蔓延，嚴重危及全球公共衛生體系和人類(lèi)生命安全。據WHO統計，截至2021年12月29日，全球累計COVID-19確診病例超2.81億，累計死亡人數達541萬(wàn)。多種SARS-CoV-2變異株的陸續出現，尤其是在英國首次檢測到的B.1.617變異株 （德?tīng)査局辏òㄆ鋪喿兎NAY.4.2） 和近日在南非首次檢測到的B.1.1.529變異株 （奧密克戎毒株） 具有傳播力強、潛伏期短、致病性強、發(fā)病進(jìn)程快等特點(diǎn)，已導致全球多國疫情出現反彈。這對進(jìn)行有針對性的COVID-19臨床診治及預防策略提出了更高的要求?；诔纱匾幝砷g隔短回文重復序列及其相關(guān)蛋白 （clustered regularly interspaced short palindromic repeat and associated protein，CRISPR-Cas） 系統的基因編輯技術(shù)近幾年發(fā)展迅速，應用范圍幾乎延伸到生命科學(xué)的每個(gè)角落[2]?；?span>CRISPR-Cas系統的各種病原體核酸檢測方法，不需要復雜昂貴的設備、操作簡(jiǎn)單，極大地減少了實(shí)驗室負荷和患者檢測成本，使得現場(chǎng)即時(shí)檢測 （point of care test，POCT） 得以實(shí)現，可及早地追蹤和隔離被感染人群，快速阻斷病毒傳播[3]。諸多研究已嘗試將該技術(shù)應用到COVID-19的早期診治及預防，以期開(kāi)發(fā)出更加靈敏快速的病毒核酸檢測方法和安全有效的新型治療及預防方案。本文在簡(jiǎn)述目前COVID-19診治現狀的基礎上，對基于CRISPR-Cas系統的COVID-19分子診斷、治療及預防策略的研究及其新進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。 

1、COVID-19診治現狀 

1.1、常用的SARS-CoV-2檢測方法

       SARS-CoV-2完整的基因組約為30 kb，其中接近5’端的前2/3包含編碼16個(gè)非結構蛋白的開(kāi)放閱讀框1ab （open reading frame 1ab，ORF1ab） 基因，后1/3包含編碼結構蛋白的基因包括包膜蛋白 （envelope protein，E） 、刺突蛋白 （spike protein，S） 、核衣殼蛋白 （nucleocapsid protein，N） 、膜蛋白 （membrane protein，M） 基因。 定量逆轉錄PCR （quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR） 現被作為COVID-19診斷的金標準，WHO和我國均建議選用至少包含針對ORF1ab和N基因區域的qRT-PCR核酸檢測試劑盒 （包含TaqMan聚合酶、引物和探針） 作為COVID-19確診方法。但在感染早期qRT-PCR檢測仍可呈假陰性，同時(shí)有檢測成本貴、樣本運轉/檢測周期長(cháng)以及人員和設備要求高等缺點(diǎn)。應用間接免疫熒光法、直接發(fā)光免疫法、ELISA、膠體金免疫層析等技術(shù)檢測呼吸道分泌物中的SARS-CoV-2抗原或血清抗體，也被各國作為SARS-CoV-2感染診斷或治療監測的輔助手段。雖然這些免疫學(xué)檢測抗原或抗體的試劑有的已上市并應用于臨床檢測，但仍存在交叉反應、檢測窗口期較長(cháng)、假陽(yáng)性率高等許多缺陷。 

1.2、目前COVID-19的治療與預防手段

       迄今為止，全球各國已經(jīng)評估了各種可能的COVID-19治療與預防手段，其中包含多種化學(xué)藥物、中和抗體和各種處于不同臨床試驗階段或已經(jīng)上市的疫苗。對于COVID-19具有潛在療效的候選藥物有瑞德西韋、洛匹那韋、氯喹和羥氯喹、法匹拉韋等，雖然這些候選藥物在小規模臨床試驗中均被證明具有一定的抗SARS-CoV-2活性，但在WHO牽頭組織的全球最大用于評估COVID-19治療方法的臨床試驗——“團結”試驗 （SOLIDARITY trial） 中瑞德西韋、羥氯喹、洛匹那韋對COVID-19的治療效果都十分有限甚至無(wú)效。好消息是法匹拉韋已在多個(gè)國家的臨床試驗中展現出有效性，尤其是針對輕癥和中癥患者的治療，并且在包括中國在內的多個(gè)國家上市；最近，抗SARS-CoV-2口服藥Molnupiravir獲英國藥監局批準上市，用于成人輕癥至中癥COVID-19的治療；美國輝瑞公司新口服藥PAXLOVIDTM的Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗結果顯示，該藥可使患者重癥或者死亡風(fēng)險降低89%，目前已向美國FDA提交緊急使用授權（ emergency use authorization，EUA） 申請。清肺排毒湯、化濕敗毒方、宣肺敗毒顆粒、金花清感顆粒、連花清瘟膠囊、血必凈注射液等3個(gè)中藥方劑和3個(gè)中成藥已被證實(shí)對COVID-19有明顯療效，聯(lián)合西藥治療可明顯提高治愈率。 中和抗體療法也是治療COVID-19的一個(gè)熱門(mén)領(lǐng)域，如從COVID-19康復患者的恢復期血漿中篩選出的單克隆中和抗體，通過(guò)與SARS-CoV-2的S蛋白結合，阻斷病毒與宿主細胞結合，病毒無(wú)法侵入細胞，最終被免疫系統消滅。全球現有20種中和抗體藥物研發(fā)進(jìn)入臨床試驗，其中美國禮來(lái)公司和上海君實(shí)生物醫藥科技股份有限公司合作開(kāi)發(fā)的Etesevimab/Bamlanivimab聯(lián)合療法、美國再生元制藥公司的卡西瑞單抗和伊德單抗組合療法、美國VirBiotechnology公司和英國葛蘭素史克公司合作的Sotrovimab均已獲得美國FDA的EUA。 針對全球COVID-19疫情的暴發(fā)及蔓延，世界各國都加快了疫苗的研發(fā)、生產(chǎn)及審批，乃至授權應急使用審批速度，以滿(mǎn)足提高公共群體免疫水平、有效控制疾病流行需要。WHO于2021年10月28日更新的COVID-19疫苗緊急使用名單顯示，24種COVID-19候選疫苗中已通過(guò)認證并獲準緊急使用的僅14種 （包括我國2種） ，其他10種疫苗尚未完成相關(guān)認證。此外，WHO最近發(fā)布的全球COVID19疫苗開(kāi)發(fā)概況表明，已有322種候選疫苗，其中128種處于臨床試驗階段。目前已有的COVID-19疫苗包括滅活疫苗、核酸疫苗、病毒載體疫苗、重組亞單位疫苗等。隨著(zhù)更加深入的研究，核酸疫苗在免疫原性、安全性和持續性方面都獲得了極大的進(jìn)步，其中為應對COVID-19疫情首次使用的mRNA疫苗尤為引人關(guān)注。mRNA具有良好的保護效力且安全性可控，可在體內正常降解，理論上不會(huì )與宿主基因整合，與傳統疫苗相比，生產(chǎn)周期更短、研發(fā)成本更低，但運輸與保存條件的要求更高。目前，美國輝瑞公司/德國BioNTech公司聯(lián)合研制的BNT162b2 mRNA疫苗以及美國Moderna公司開(kāi)發(fā)的mRNA-1273疫苗已獲得緊急使用批準上市。 

2、基于CRISPR-Cas系統的COVID-19分子診斷 

2.1、基于CRISPR-Cas13的COVID-19診斷

       Cas13a是CRISPR-Cas家族中唯一一種可以靶向單鏈RNA的效應蛋白，且具備非特異性反式切割鄰近單鏈RNA的活性，這些特性可以靶向識別目標RNA并利用報告分子的斷裂將信號放大，為利用CRISPR-Cas13檢測RNA病毒SARS-CoV-2提供了機會(huì )。華裔學(xué)者張鋒團隊建立的一種基于Cas13a的特異高靈敏度酶報告系統 （specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking, SHERLOCK） 已被用于檢測SARS-CoV-2，在42個(gè)RNA拷貝的檢出限內熒光讀數的靈敏度和特異性均為100%，橫向流動(dòng)讀數靈敏度和特異性分別為97%、100%。Arizti-Sanz等建立的簡(jiǎn)化突出顯示感染以應對流行病的方法 （streamlined highlighting of infections to navigate epidemics，SHINE） 實(shí)現免樣本核酸提取且將等溫擴增和基于Cas13的檢測融合為一步，在縮短檢測時(shí)間的同時(shí)可提高靈敏度，結果可以通過(guò)管內熒光讀數進(jìn)行可視化并由配套的智能手機應用程序進(jìn)行解讀，減少污染風(fēng)險。Rauch等設計的堅固、精準、可擴展的基于CRISPR-Cas13a的檢測方法 （Cas13-based, rugged, equitable, scalable testing，CREST） 將RT-PCR擴增與Cas13a酶相結合，設備只包括簡(jiǎn)易小巧的熱循環(huán)儀和基于塑料過(guò)濾器的LED顯像儀，特別適合現場(chǎng)檢測，且成本低，靈敏度高。 

2.2、基于CRISPR-Cas12的COVID-19診斷

       Cas12同樣有反式切割活性，但只能靶向切割雙鏈DNA，利用逆轉錄等溫擴增技術(shù)可讓基于CRISPR-Cas12的檢測方法實(shí)現對SARS-CoV-2或其他RNA病毒的檢測，原理與Cas13相似。近來(lái)張鋒團隊發(fā)布了更簡(jiǎn)易的SARS-CoV-2核酸檢測方法STOPCovid （SHERLOCK testing in one pot） ，把逆轉錄環(huán)介導等溫擴增 （reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP） 和SHERLOCK合并進(jìn)行，靈敏度與qRT-PCR相當，最大優(yōu)點(diǎn)是不需要從患者樣本中提取和純化RNA，檢測SARS-CoV-2只需在一個(gè)試管中一步完成，陽(yáng)性樣本只需15~45 min就能獲得結果，特別適于POCT場(chǎng)景使用。Broughton等將前期建立的基于CRISPR-Cas12a的針對DNA內切酶靶向的CRISPR反式報告檢測系統 （DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter，DETECTR） 和RT-LAMP技術(shù)結合，可檢測SARS-CoV-2 N和E基因。Ding等[18]設計的多合一的雙CRISPR-Cas12a檢測技術(shù) （all-in-one dual CRISPR-Cas12a，AIOD-CRISPR） 不需要預擴增和分離擴增產(chǎn)物，該方法利用一對Cas12a CRISPR RNA （crRNA） 復合物結合目標序列的不同位點(diǎn)，且不受Cas12a前間區序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）序列的限制，檢測結果在藍色LED燈背景下可直接用肉眼讀出。另一種基于CRISPR-Cas12a的肉眼讀出檢測方法 （CRISPR/Cas12a-based-detection with naked eye readout，CRISPR/Cas12a-NER） 利用逆轉錄重組酶介導等溫核酸擴增技術(shù) （reverse transcript recombinase-aided amplification，RT-RAA） 對SARS-CoV-2進(jìn)行預擴增，結果符合率達100%。另外，Zhang等首次結合金納米顆粒 （gold nanoparticle，AuNP） 建立了Cas12a輔助的RT-LAMP/AuNP檢測 （Cas12a-assisted RT-LAMP/AuNP，CLAP） ，該檢測可同時(shí)在96孔板中進(jìn)行，僅通過(guò)肉眼或普通的酶標儀就能讀出結果，具有擴展到自動(dòng)化檢測平臺的潛力，這種高通量的檢測方法將很大程度地改進(jìn)當前COVID-19的快速篩查工作。圖1展示了幾種主要的基于CRISPR-Cas12/13的COVID-19分子診斷技術(shù)原理。

2.3、基于其他CRISPR-Cas系統的COVID-19診斷

        Cas9、Cas3等其他CRISPR-Cas系統雖然沒(méi)有反式切割活性，無(wú)法實(shí)現游離報道分子的信號放大，但利用其靶向結合的活性同樣可以準確檢測出SARS-CoV-2的RNA序列?；?span>Cas3操作的核酸檢測方法 （Cas3-operated nucleic acid detection，CONAN） ，最快能在40 min內檢測出單拷貝SARS-CoV-2 RNA。Azhar等首次開(kāi)發(fā)出一種基于CRISPR-Cas9系統檢測SARS-CoV-2的方法FELUDA （FnCas9 editor linked uniform detection assay） ，試劑盒已獲準在印度上市銷(xiāo)售。該法無(wú)需對報告分子進(jìn)行反式切割，直接利用Cas9的酶切作用進(jìn)行核酸檢測，準確度與qRT-PCR檢測相似，并且在檢測致病性單核苷酸變異和核酸序列分析方面準確度也很高。表1列出了qRT-PCR以及各種基于CRISPR-Cas系統的SARS-CoV-2核酸檢測方法的性能特征。

3、基于CRISPR-Cas系統的抗SARS-CoV-2治療及預防策略 

3.1、基于CRISPR-Cas系統的抗SARS-CoV-2治療

       已有報道證明Cas13d可被編程用于精準抑制哺乳動(dòng)物體內多種單鏈RNA病毒而不會(huì )丟失目標基因，Cas13d具有靶向多個(gè)區域的能力且有更強的催化活性，不需要任何嚴格的PAM/前間區序列側翼序列來(lái)限制切割靶點(diǎn)，這使得CRISPR-Cas13d成為抗病毒治療研發(fā)的熱點(diǎn)。Abbott等[25]以CRISPR-Cas13d為基礎開(kāi)發(fā)了一種新技術(shù)，人類(lèi)細胞中的預防性抗病毒CRISPR （prophylactic antiviral CRISPR in human cell，PAC-MAN） 系統。通過(guò)對47例COVID-19和中東呼吸綜合征患者的基因組序列進(jìn)行比對，借助生物信息學(xué)流程建立了與人類(lèi)基因組脫靶效應較小的針對高度保守的RNA依賴(lài)的RNA聚合酶和N基因的crRNA文庫，在人肺上皮細胞系中PAC-MAN對SARS-CoV-2的抑制率分別為85%和70%，研究顯示，PAC-MAN系統僅靠6個(gè)crRNA就足以靶向切割包括SARS、中東呼吸綜合征和COVID-19相關(guān)的β冠狀病毒在內的超過(guò)90%的冠狀病毒基因，證明PAC-MAN可以成為一種潛在的抗SARS-CoV-2策略。然而如何安全有效地將CRISPR組件遞送至人體細胞中并持續發(fā)揮作用是基于CRISPR-Cas系統的新型抗病毒治療應用于臨床的主要難題。腺相關(guān)病毒 （adeno-associated virus，AAV） 或慢病毒載體是病毒載體遞送系統的代表，為了將Cas有效地遞送到受感染細胞中，張峰團隊發(fā)現了一種最小的Cas13效應蛋白Cas13bt （僅有其他Cas13蛋白的一半大?。?，可被直接裝入單個(gè)AAV載體內進(jìn)行遞送，Nguyen等[28]利用肺特異性AAV血清型載體將Cas13d效應蛋白和針對SARS-CoV-2 ORF1ab和S基因的特異性crRNA傳遞至SARS-CoV-2感染者肺上皮細胞，降解了SARS-CoV-2基因組抑制病毒復制。 另外，抗體與Cas酶融合 （antibody and Cas fusion，ABACAS） 技術(shù)可以通過(guò)將Cas13核酸酶與SARS-CoV-2的S蛋白特異性抗體片段融合來(lái)實(shí)現CRISPR組件的連接，ABACAS的抗體片段將識別SARS-CoV-2上的S蛋白，并促進(jìn)Cas13與病毒一起選擇性地遞送至受感染細胞中，一旦ABACAS被傳遞到受感染的細胞，它就會(huì )識別并切割病毒RNA，依靠病毒本身的選擇性傳遞也可減少組織外效應。ABACAS技術(shù)除了選擇性遞送CRISPR-Cas系統外，ABACAS抗體片段的中和活性還可能會(huì )干擾S蛋白和血管緊張素轉化酶2受體的相互作用，并最大限度地減少病毒進(jìn)入宿主細胞。非病毒載體遞送包括脂質(zhì)納米顆粒法、電穿孔法、核轉染法、顯微注射法等，其中脂質(zhì)納米顆粒法以其無(wú)毒性、低免疫原性、可增加Cas酶在體外和體內表達時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)脫穎而出。Blanchard等將合成的Cas13a mRNA和針對SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因的crRNA的脂質(zhì)納米聚合物通過(guò)霧化裝置輸送到受感染倉鼠的呼吸道，結果表明CRISPR-Cas13a可以減少倉鼠體內SARS-CoV-2的復制并減輕癥狀。合成的mRNA使Cas13a效應子在倉鼠體內瞬時(shí)表達，很大程度減輕了免疫應答，也減少了mRNA與受試者自身遺傳物質(zhì)整合的可能性。Fareh等報道了一種可編程的CRISPR-pspCas13b針對SARS-CoV-2的S、N基因轉錄后的mRNA，抑制具有感染復制能力的SARS-CoV-2，包括猴子和人類(lèi)上皮細胞中的未變異株、D614G變體和最近飽受關(guān)注的B.1.1.7變體。該研究的綜合突變分析進(jìn)一步證明單個(gè)crRNA對單核苷酸錯配具有耐受性，并對新變種中出現的突變RNA仍保持催化活性，為開(kāi)發(fā)能夠抑制廣大SARS-CoV-2突變體的治療策略提供了概念驗證。然而，這些研究還需要更廣泛的臨床前研究，還需要進(jìn)一步了解其免疫原性、CRISPR組件的遞送、Cas蛋白表達的時(shí)間，以及脫靶效應等問(wèn)題。 

3.2、基于CRISPR-Cas系統的COVID-19預防

       目前已有多篇利用CRISPR-Cas9系統構建開(kāi)發(fā)動(dòng)物疫苗候選毒株的報道。譬如利用CRISPR-Cas9系統構建偽狂犬病病毒基因缺失的疫苗候選毒株；利用CRISPR-Cas9系統敲除非洲豬瘟病毒強毒株中的非必需基因8-DR，為后續非洲豬瘟疫苗的研制奠定基礎；利用CRISPR-Cas9系統敲除毒力因子，并將異源基因插入禽類(lèi)易感的皰疹病毒科傳染性喉氣管炎病毒基因組中，以產(chǎn)生多價(jià)禽皰疹病毒重組疫苗等[33]。CRISPR-Cas系統通過(guò)基因敲除、替換或插入對病毒基因組進(jìn)行修飾，構建具有多種重組基因疫苗候選毒株，為人用病毒性疫苗的研究提供了一條新的有效途徑。此外，應用CRISPR-Cas9系統在編輯哺乳動(dòng)物細胞基因組方面的準確性，或許可以改造動(dòng)物體內B細胞的基因組，使B細胞直接表達出高效價(jià)的特異性抗體以預防病毒感染。Faiq[34]提出假設，利用CRISPR-Cas9編輯B細胞基因組以表達針對不同抗原的單克隆抗體，并通過(guò)在宿主B細胞基因組中插入表達針對SARS-CoV-2抗體的核酸序列，可能在不引入病毒表面蛋白或多肽的情況下表達出抗SARS-CoV-2抗體。這將能消除重復注射的需要，同時(shí)可以在一個(gè)月內實(shí)現有效對抗某種病毒的暴發(fā)。毫無(wú)疑問(wèn)，基于CRISPR-Cas系統的基因編輯技術(shù)為設計、研發(fā)、生產(chǎn)出更快速、更安全、更多價(jià)的諸如COVID-19疫苗等重組病毒疫苗提供了新的可能的技術(shù)手段。 

4、小結與展望 

       COVID-19在世界范圍內的大流行導致人類(lèi)生產(chǎn)生活和生命健康受到嚴重損害，快速實(shí)時(shí)的分子診斷檢測技術(shù)、切實(shí)有效的新型治療及預防策略成為戰勝全球疫情的關(guān)鍵。PCR和DNA測序技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了對新發(fā)病原體的快速檢測能力，成為疫情初期最有力的診斷工具?；?span>CRISPR-Cas系統的分子診斷技術(shù)已被證明具有靈敏、特異、快速、廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)，在資源有限的地區，基于橫向流動(dòng)試紙條的快速檢測方法可以很容易地檢測SARS-CoV-2病毒核酸，大規模利用這些方法篩查受感染人群 （或居家自我監測） 將有助于限制病毒傳播。雖然這些技術(shù)只有個(gè)別獲得FDA的EUA （美國Sherlock Biosciences公司開(kāi)發(fā)的SHERLOCK? CRISPR SARS-CoV-2和Mammoth Biosciences公司的SARS-CoV-2 DETECTR?核酸檢測試劑盒） ，但隨著(zhù)更多試劑研發(fā)生產(chǎn)企業(yè)的參與，越來(lái)越多的基于CRISPR-Cas的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒將會(huì )陸續進(jìn)入臨床使用，可能在不久的將來(lái)替代qRT-PCR成為分子診斷領(lǐng)域的主流。另外，尋找更有效的COVID-19抗病毒治療及預防手段，也是世界各國學(xué)者目前研究的重點(diǎn)及難點(diǎn)。PAC-MAN和ABACAS是基于CRISPR-Cas系統用于COVID-19治療中的代表性示例，只需設計出針對病毒保守序列的crRNA，就能靶向降解病毒核酸抑制病毒增殖，有助于提高未來(lái)應對變異病毒或新病毒暴發(fā)的能力。評估使用CRISPR的潛在風(fēng)險對于其未來(lái)的臨床應用十分重要，研發(fā)合適的傳遞系統以保證CRISPR的專(zhuān)一性、安全性和高效性，并排除脫靶效應所致突變及腫瘤的發(fā)生風(fēng)險，是目前PAC-MAN等技術(shù)應用于COVID-19患者治療急需解決的難題所在。此外，CRISPR-Cas系統應用于新型病毒性疫苗的研發(fā)，將大大縮短疫苗研發(fā)周期，為應對諸如COVID-19這類(lèi)傳染病的大流行提供全新的預防策略及解決方案。 

作者：劉錦嵩  鄢盛愷，遵義醫科大學(xué)檢驗醫學(xué)院 通信作者：鄢盛愷

引用本文：劉錦嵩，鄢盛愷. 針對新型冠狀病毒肺炎的基于CRISPR-Cas系統分子診斷及治療策略研究 [J]. 國際生物制品學(xué)雜志, 2022, 45(1): 1-7.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20211102-00068