CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）是一段成簇、規則間隔的短回文重復序列。其與CRISPR相關(guān)蛋白（CRISPR-associated protein, Cas）組成的CRISPR/Cas系統是廣泛存在于多數細菌和古細菌中的一種適應性免疫系統。

CRISPR/Cas系統主要通過(guò)適應，表達和干擾三個(gè)階段來(lái)介導細菌的免疫過(guò)程（見(jiàn)圖1，圖片來(lái)自Barrangou, R. and Marraffini, L. Molecular Cell .2014.）。首先，在適應階段，與病毒或質(zhì)粒序列同源的DNA短片段會(huì )被整合到CRISPR的間隔區；在表達階段，CRISPR基因序列的一級轉錄本pre-crRNA產(chǎn)生，并被加工成crRNA，crRNA與病毒或質(zhì)粒的靶序列匹配；在干擾階段，crRNA將Cas蛋白引導至與間隔區匹配的病毒或質(zhì)粒處形成效應復合物，并利用Cas蛋白切割靶序列。其中，PAM序列是crRNA引導Cas蛋白正確識別靶序列的必要條件。

                               圖1

法國科學(xué)家Emmanuelle Charpentier在對化膿性鏈球菌的研究中發(fā)現了tracrRNA，并且2011年開(kāi)始與Jennifer Doudna合作。Doudna是一位經(jīng)驗豐富的生物化學(xué)家，對RNA有著(zhù)豐富的知識。她們一起成功地在試管中再造了細菌的基因剪刀，并簡(jiǎn)化了剪刀的分子組成，使其更容易使用。兩個(gè)人因為發(fā)現CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)而獲得2020年諾貝爾化學(xué)獎。其實(shí)還有一些生物學(xué)家對基因編輯技術(shù)做出了很多貢獻，例如華人科學(xué)家張鋒首次證明CRISPR基因編輯可用于真核生物中。

之后大家繼續思考，既然crRNA可以引導Cas蛋白特異性識別靶序列，那CRISPR技術(shù)是否也可以應用于核酸檢測中？答案是肯定的。隨著(zhù)對CRISPR/Cas系統研究的不斷深入，Cas蛋白的特點(diǎn)及功能活性被逐漸認識并應用，并且發(fā)現了更多的Cas蛋白，Cas12a、Cas13a等被定義并命名。表1中列出用于分子診斷的CRISPR/Cas系統及其特點(diǎn)。其中可以看到，Cas12a主要靶向單鏈或雙鏈DNA，而Cas13a可以直接靶向RNA。

                               表1

2018年，Chen等研究發(fā)現當CRISPR/Cas12a蛋白以序列特異性的方式切割dsDNA時(shí)，會(huì )誘發(fā)強烈的、非特異性ssDNA 的反式切割。作者利用Cas12a 這一附屬切割活性開(kāi)發(fā)了一種準確快速的檢測方法。該檢測方法將Cas12a 與等溫擴增相結合，命名為DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter)，并實(shí)現患者樣品中人乳頭瘤病毒(HPV)高靈敏檢測。

從樣本中提取HPV的DNA，通過(guò)重組聚合酶等溫擴增對DNA進(jìn)行擴增，再將Cas12a-crRNA復合物和標記有熒光淬滅的單鏈DNA探針加入反應體系。當Cas12a-crRNA復合物特異性結合并切割HPV的DNA時(shí)，激活Cas12a的非特異反式切割，即對單鏈DNA探針進(jìn)行切割，ssDNA熒光基團在被切割后產(chǎn)生熒光信號并完成對樣本中HPV DNA的特異性檢測。DETECTR可以對樣本中HPV16和HPV18進(jìn)行準確檢測，相關(guān)原理示意圖見(jiàn)圖2。對25個(gè)樣本進(jìn)行DETECTR檢測結果與普通PCR檢測進(jìn)行對比，結果完全符合。

                      圖2

LwCas13a是第一個(gè)被用于核酸檢測中的Cas13a蛋白。Gootenberg等開(kāi)發(fā)的基于Cas13a蛋白的檢測技術(shù)與等溫擴增技術(shù)結合，既可以檢測DNA靶標，也可以檢測RNA靶標。該技術(shù)被命名為SHERLOCK (Specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking)。檢測原理如圖3-a，由于Cas13a識別RNA靶標，所以RPA擴增后需要將產(chǎn)物轉錄為RNA，后面的過(guò)程與DETECTR相似，Cas13a-crRNA特異結合RNA靶標后，Cas13a的非特異性反式切割活性被激活，對周?chē)臒晒馓结樳M(jìn)行切割從而發(fā)出熒光進(jìn)行檢測。

2018年Gootenberg等對SHERLOCK技術(shù)進(jìn)行升級，可以實(shí)現在單個(gè)反應中檢測3 個(gè)ssRNA 靶標和1 個(gè)dsDNA靶標。研究人員對17 種CRISPR/Cas13a 和/Cas13b 酶進(jìn)行了生化鑒定，選擇了3 種具有不同切割偏好的Cas13 蛋白(LwaCas13a、PsmCas13b 和CcaCas13b)與Cas12a 和RPA結合使用，每一種擴增的核酸靶標與對應的Cas-crRNA 相結合，可激活對應Cas蛋白的活性而切割其對應的特異性底物，從而產(chǎn)生多種不同的熒光響應，實(shí)現對不同靶標的檢測。相關(guān)原理見(jiàn)圖3-b。

                                    圖3

但是根據上面的應用可以看出，CRISPR/Cas技術(shù)通常需要與等溫擴增等技術(shù)一起使用才能完成檢測，需要RPA對目標靶標擴增后，CRISPR/Cas主要發(fā)揮的是特異性檢測的作用，是否可以不經(jīng)RPA等技術(shù)擴增而直接利用CRISPR技術(shù)進(jìn)行核酸檢測呢？很多學(xué)者也在這方面進(jìn)行了各種探索。

Hajian等在2019年開(kāi)發(fā)一種CRISPR芯片，該芯片材質(zhì)基底為石墨烯，利用場(chǎng)效應晶體管與CRISPR/Cas系統結合來(lái)檢測是否有目標序列的存在。石墨烯芯片上預制許多CRISPR/dCas9分子復合物。其中dRNP復合體可以解旋雙螺旋DNA，并且掃描整條DNA鏈，如果發(fā)現目標序列，dRNP復合體就可以調控場(chǎng)效應晶體管來(lái)輸出電信號完成檢測。但是整個(gè)芯片的檢測成本較高。相關(guān)示意圖見(jiàn)圖4.

                                      圖4

2019年，Dai等通過(guò)探索Cas12a（cpf1）的反式剪切活性，想要開(kāi)發(fā)一種通用的電化學(xué)傳感器。如圖5所示，Cas12a既有crRNA介導的特異性的順式剪切（cis-cleavage），也有非特異性的反式剪切活性（trans-cleavage）。圖5B中結合有亞甲基藍燃料的非特異的單鏈DNA報告分子被固定在金電極上。如果存在目標分子，Cas12a-crRNA就會(huì )介導對非特異ssDNA報告分子的反式剪切，產(chǎn)生較低的電化學(xué)信號；而如果沒(méi)有目標分子存在，Cas12a-crRNA不會(huì )激活其反式剪切活性，報告分子不會(huì )被切割，就會(huì )產(chǎn)生比較高的電化學(xué)信號，以此來(lái)判斷是否存在目標序列。

                                                                              圖5

CRISPR技術(shù)在核酸檢測中優(yōu)點(diǎn)主要有：

1）對單堿基突變有很高的分辨率；

2）更高的特異性和靈敏度；

3）陸續發(fā)現新的更有價(jià)值的Cas蛋白，可以更特異以及準確的進(jìn)行分子檢測。

但是同時(shí)也有相應的局限性：

1）設計時(shí)在3’端需要合適的PAM序列，PAM序列使crRNA引導Cas蛋白正確識別靶序列的必要條件；

2）目前在多重檢測中還有許多限制；

3）目前大部分都是與RPA等擴增技術(shù)聯(lián)合使用，但是擴增也可能會(huì )引入誤差，同時(shí)也有污染的風(fēng)險。

CRISPR/Cas技術(shù)在核酸檢測中發(fā)揮了重要作用，為核酸檢測提供了新的思路。未來(lái)的研發(fā)方向主要是更加流程化，減少中間的操作步驟，使得檢測更加快速和便捷。隨著(zhù)基于CRISPR/Cas技術(shù)的核酸檢測平臺的不斷發(fā)展，未來(lái)在分子診斷方面將發(fā)揮更重要的作用。

參考文獻

1.周桓等，Acta Microbiologica Sinica，2021,61(12):3856-3869.

2.Chen, et al. Science. 2018; 360(6387):436-439.

3.Gootenberg, et al. Science. 2017;356(6336):438-442.

4.Gootenberg, et al. Science. 2018; 360: 439-444.

5.Liu, et al. Lab Chip, 2023, 23, 1467–1492.

6.Hajian, et al. Nat Biomed Eng. 2019; 3(6): 427-437.

7.Dai, et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2019; 58(48): 17399-17405.

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