近年來(lái)，以CRISPR/Cas為代表的基因編輯帶來(lái)了生物技術(shù)革命性的進(jìn)步，分別在2015和2017年兩次被Science評為年度突破性科學(xué)進(jìn)展之首，獲評Nature近10年最具影響力的五大科學(xué)事件之首和2020年諾貝爾化學(xué)獎。短短幾年時(shí)間，CRISPR技術(shù)成為科研界的熱門(mén)內容，被稱(chēng)為下一代分子診斷技術(shù)！

CRISPR/Cas系統介紹:

     1987年，CRISPR 位點(diǎn)在細菌基因組中被發(fā)現，2002年CRISPR相關(guān)蛋白被發(fā)現，隨后證實(shí)CRISPR-Cas系統是一種RNA引導的適應性免疫系統，可以抵御病毒、質(zhì)粒等入侵遺傳元素，其免疫過(guò)程大致可以分為三個(gè)階段：適應、表達和干擾。

（1）適應階段Cas蛋白識別并捕獲外來(lái)核酸片段，獲取新間隔序列，并整合插入自身CRISPR陣列，形成免疫記憶。

（2）表達階段當外來(lái)核酸再次入侵時(shí)，從CRISPR陣列中相對應的間隔序列，轉錄出CRISPRRNA（crRNA）前體并加工獲得小的、成熟的crRNA，其中包含一個(gè)保守的重復序列和一個(gè)間隔序列，crRNA進(jìn)一步與一個(gè)或多個(gè)Cas蛋白相互作用，形成RN（ribonucleoprotein）復合體。

（3）干擾階段Cas-crRNA復合體識別外來(lái)核酸，通過(guò)crRNA靶向目標核酸區域，介導Cas蛋白特異性地破壞入侵核酸。

CRISPR/Cas可分為二大類(lèi)群：第1類(lèi)以多個(gè)Cas組成的效應復合體行使功能為特征，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；第2類(lèi)則只需單個(gè)多結構域的Cas，包括Ⅱ（Cas9）、Ⅴ（Cas12）和Ⅵ（Cas13）型。第2類(lèi)系統簡(jiǎn)單、高效、操作方便，是目前主要的基因編輯系統，其中最具代表性的是Cas9。

                                                                                 Cas9編輯基因原理

     相比Cas9，Cas12a和Cas13a僅需crRNA 即可實(shí)現特異性靶位點(diǎn)切割，這表明其系統更為簡(jiǎn)潔，具有成為精度更高、安全性更好的新一代基因編輯工具的潛力。

基于Cas12a的分子檢測系統:

      廣泛應用于核酸檢測的三種Cas12a蛋白包括LbCas12a、AsCas12a和FnCas12a，其中LbCas12a的反式切割活性最強。2017年Jennifer Doudna團隊開(kāi)發(fā)了DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）檢測技術(shù)，利用LbCas12a（Lachnospiraceae bacterium ND2006）與crRNA復合物，并在crRNA引導下利用RuvC結構域切割PAM（TTTN）序列下游18~25nt的靶DNA，在識別并切割靶標dsDNA的同時(shí)，激發(fā)Cas12a的反式切割活性，切割反應體系中的ssDNA報告分子。ssDNA報告分子標記有熒光基團和猝滅基團，一旦切割，熒光基團和猝滅基團被分離，就會(huì )產(chǎn)生穩定而強烈的熒光信號，熒光信號的強度可以指示檢 測樣本中靶標的量。此外，DETECTR還與重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)結合（recombinase polymerase amplification，RPA），不僅提高了檢測分析的靈敏度（amol/L水平），而且避免了對復雜、昂貴設備的需求。該技術(shù)現已成功應用于人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）和SARS-CoV-2的檢測。

                          DETECTR檢測方法原理圖

2018年王金、趙國屏團隊建立了HOLMES（one-hour lowcost multipurpose highly efficient system）檢測技術(shù)，聯(lián)合LbCas12a與PCR擴增，可以在1 h內完成對偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）和日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）的檢測，靈敏度可以達到1～10 amol/L，此外還可以準確區分病毒基因型以及人類(lèi)的單核苷酸多態(tài)性 。但是，該技術(shù)聯(lián)合PCR擴增提高穩定性的同時(shí)也增加了檢測時(shí)間和設備依賴(lài)性。

基于Cas12b的分子檢測系統:

    來(lái)源于嗜熱菌的Cas12b含有單個(gè)RuvC結構域，脫靶效應低且同樣具有反式切割活性。CRISPRCas12b是雙RNA引導的DNA核酸內切酶系統，可以識別和切割靶向dsDNA或ssDNA，也可以非特異性切割ssDNA。當靶向dsDNA時(shí)，Cas12b依靠PAM序列（TTC或TAC）完成順式切割。當靶向ssDNA時(shí)，Cas12b可不依賴(lài)PAM序列實(shí)現切割，而且切割活性高于dsDNA。

    根據這些特性，王金、趙國屏團隊建立了升級版的HOLMESv2，將AacCas12b（Alicyclobacillus acidoterrestris）蛋白與環(huán)介導等溫擴增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）結合，只有含有5?-TTC-3?的dsDNA或切割后具有的5?-TAC-3?的DNA序列才能激活AacCas12b反式切割活性，該技術(shù)實(shí)現了DNA、RNA特異性檢測以及區分SNP和定量DNA甲基化。

   2019年，Dai等開(kāi)發(fā)了基于CRISPR-Cas12a的E-CRISPR檢測技術(shù)，通過(guò)CRISPR-Cas系統來(lái)影響電信號輸出，利用Cas12a的反式切割活性獲得高傳導信號。該檢測技術(shù)將修飾有3′-亞甲基藍（3′-MB）標簽的ssDNA報告分子固定于金電極上，在靶DNA存在的情況下，Cas12a-crRNA反式切割MB-ssDNA分子，亞甲基藍標簽的分離，會(huì )使電化學(xué)信號降低。在沒(méi)有靶標DNA存在時(shí)，Cas12a的反式切割活性保持沉默，ssDNA分子保留在電極表面，從而導致亞甲基藍的高電化學(xué)電流。

                                                                     SHERLOCK檢測方法原理

    2020年，Ding等開(kāi)發(fā)了AIOD CRISPR（all-in-one dual CRISPR-Cas12a）檢測技術(shù)，將RPA擴增和CRISPR檢測的所有反應組分混合，在引入兩個(gè)crRNA的同時(shí)，添加高濃度ssDNA報告分子，一步即可完成對SARS-CoV-2和HIV-1的檢測。

基于Cas13的分子檢測系統：

    Cas13是RNA引導和RNA靶向的核酸酶，具有兩個(gè)HEPN結構域，特異性作用于RNA靶標。2017年，張峰團隊開(kāi)發(fā)了SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）核酸檢測技術(shù)。該技術(shù)與DETECTR原理相同，但依賴(lài)于LwaCas13a（Leptotirichia wadei）核酸酶的活性，識別和切割靶標RNA的同時(shí)，反式切割ssDNA報告分子產(chǎn)生熒光信號。

                                                                             SHERLOCK檢測方法原理

   為了解決定量的問(wèn)題，該團隊開(kāi)發(fā)了SHERLOCKv2，將4種類(lèi)型的Cas蛋白（LwaCas13a、PsmCas13b、CcaCas13b和AsCas12a）組合使用，切割用不同的熒光基團標記的報告分子，在FAM、Cy5、HEX和TEX通道中進(jìn)行檢測，實(shí)現了定量同時(shí)檢測4種核酸序列。SHERLOCKv2也被應用于側向流動(dòng)分析，通過(guò)金納米顆粒標記的抗FAM抗體，在試紙條上檢測被切割的報告分子，產(chǎn)生視覺(jué)比色信號。

                                            SHERLOCKv2 檢測結果讀取方式

    2020年，ACKERMAN等聯(lián)合CRISPR診斷和微流控技術(shù)開(kāi)發(fā)了CARMEN（combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids）檢測平臺，該技術(shù)可以同時(shí)檢測8個(gè)樣本，169種人類(lèi)相關(guān)病毒。但由于芯片定制成本高和檢驗操作流程復制，很難應用于臨床。該團隊在CARMENv.1的基礎上開(kāi)發(fā)了mCARMEN（microfluidic combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids），將CRISPR診斷、微陣列技術(shù)與簡(jiǎn)化的臨床工作流程相結合，開(kāi)發(fā)的mCARMEN呼吸道病毒檢測面板，可同時(shí)檢測21種呼吸道病毒，包括SARS-CoV-2及其他冠狀病毒、流感病毒等。

                                 CARMEN-Cas13檢測方法原理

    Arizti-Sanz團隊將擴增與CRISPR-Cas13系統檢測整合為一步診斷平臺SHIN（streamlined highlight of infection to navigate pandemic），通過(guò)添加RNase H提高核酸檢測靈敏度，并采用管內熒光和配套的智能手機應用程序，實(shí)現了SARS-CoV-2有效的核酸檢測。SHINE診斷平臺最大限度地減少了對設備的要求，也減少了結果讀數偏差。

基于Cas14的分子檢測系統：

    除了Cas12和Cas13系統外，結構緊湊的Cas14蛋白也具有類(lèi)似的反式切割活性。Cas14是一種靶向ssDNA的CRISPR內切酶，與CRISPRCas12相比，Cas14識別和切割目標核酸序列不受PAM序列的限制，而且對crRNA與靶標模板之間的核苷酸錯配的容忍性更低，內部序列對核苷酸錯配更敏感，這一特性使Cas14能夠實(shí)現高保真的區分SNP?；诖颂匦越⒌腃as14a-DETECTR檢測平臺，已應用于人類(lèi)HERC2基因SNP分型。

                                                                   CRISPR/Cas14a分子檢測示意圖

CRISPR/Cas技術(shù)優(yōu)勢:

發(fā)展至目前，基于CRISPR的核酸檢測技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)高特異性，可實(shí)現單核苷酸點(diǎn)突變檢測；

(2)高靈敏性，可實(shí)現單拷貝核酸檢測；

(3)快速性，整個(gè)檢測在0.5–1.0h內完成；

(4)簡(jiǎn)便性，不需專(zhuān)業(yè)設備及人員，可現場(chǎng)完成；

(5)試劑耐受冷凍干燥，便于儲存和攜帶；

(6)易開(kāi)發(fā)性，可快速開(kāi)發(fā)出新核酸檢測試劑盒等。

      隨著(zhù)進(jìn)一步的改進(jìn)和優(yōu)化，其更具通用性，CRISPR核酸檢測技術(shù)將成為POCT的最優(yōu)選。

已報道的多種基于 CRISPR 的分子檢測技術(shù)比較

CRISPR/Cas未來(lái)方向

    第一，是新的Cas蛋白的開(kāi)發(fā)及突變體的篩選鑒定。例如后來(lái)發(fā)現的Cas14蛋白，不同于Cas12和Cas13，其擅長(cháng)識別單鏈DNA，豐富了CRISPR工具箱。而具有不同切割特性的Cas蛋白的篩選鑒定為提高檢測通量及降低“脫靶效應”提供了方法。

    第二，是將CRISPR/Cas其和其他的技術(shù)平臺結合起來(lái)，開(kāi)發(fā)新穎實(shí)用的生物傳感策略。比如將Cas9蛋白固定于石墨烯場(chǎng)效應晶體管，以及將Cas系統的報告探針固定于電極上，從而實(shí)現不需要使用信號擴增的電化學(xué)生物傳感器的構建。使用水凝膠作為其響應原件實(shí)現多樣化的信號輸出。與微流體技術(shù)結合開(kāi)發(fā)出的CARMAN技術(shù)，可以對數十個(gè)樣本，上百種病毒進(jìn)行快速檢測，為解決通量低的問(wèn)題提供了方法等。

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