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酵母雙雜交系統（Yeast two-hybrid assay）技術(shù)原理
檢測原理：
酵母雙雜交系統（Yeast two-hybrid assay）是用于體內研究蛋白相互作用的一種非常便利的工具，常用的如GAL4為基礎的系統，使用酵母轉錄因子GAL4來(lái)檢測轉錄激活后的蛋白相互作用。某些轉錄因子（如GAL4）由兩個(gè)可以分開(kāi)，功能上相互獨立的結構域組成，N端有一個(gè)147個(gè)氨基酸組成的DNA結合域（DNA binding domain，BD），C端有一個(gè)由113個(gè)氨基酸組成的轉錄激活域（transcription activation domain，AD）。BD可以和上游激活序列（UAS）結合，而AD能激活UAS下游基因進(jìn)行轉錄。單獨的BD或AD不能激活基因轉錄，兩者只有通過(guò)某種方式結合在一起形成完整的轉錄激活因子的功能。酵母雙雜交系統主要利用酵母GAL4的這個(gè)特性通過(guò)兩個(gè)雜交蛋白在酵母細胞中的相互結合及對報告基因的轉錄激活來(lái)研究活細胞內蛋白質(zhì)的相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱、瞬間的作用都能通過(guò)報告基因敏感的檢測到。酵母雙雜交系統應用：
對新的與已經(jīng)蛋白相互作用的鑒定
對預測蛋白相互作用的確認
對蛋白相互作用區域的鑒定
酵母雙雜交系統重要元件介紹（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay為例）
一、誘餌（the bait）
為了建立GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白，推薦使用質(zhì)粒pGBKT7；
要調查三元蛋白復合物，推薦使用含2個(gè)MCS區域的三雜交載體，能表達GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白和第二個(gè)感興趣蛋白，在bait和prey蛋白之間發(fā)揮橋梁作用。
二、檢測蛋白作用的四個(gè)報告基因
Matchmarker gold系統是采用4個(gè)報告基因/3個(gè)不同bait識別序列的雙雜交系統。其采用新型穩定的酵母雙雜交抗生素- 金擔子素Aureobasidin A （AbA）（貨號：M0129），可有效殺死非抗性克隆，從而大大降低背景克隆生長(cháng)。同時(shí)有效縮減假陽(yáng)性，由于人和prey蛋白單獨將結合引起假陽(yáng)性都需要識別3個(gè)不同序列，激活4個(gè)報告基因的表達。
4個(gè)報告基因分別是：1個(gè)AbA抗生素篩選報告基因，2個(gè)營(yíng)養篩選報告基因，1個(gè)藍白斑篩選報告基因。
1） AUR1-C
AUR1基因的主要突變版，能夠表達肌醇磷脂酰神經(jīng)酰胺合成酶（Inositol phosphorylceramide (IPC) synthase）。當蛋白發(fā)生作用促使GAL4轉錄激活，AUR1-C基因進(jìn)行表達。釀酒酵母中此基因的表達孵育其對高毒抗生素金擔子素Aureobasidin A （AbA）的抗性。由于其背景極其低，這一篩選報告子由于單一的營(yíng)養缺陷報告子。
2） HIS3
Y2HGold菌株不能合成組氨酸，從而無(wú)法在缺少這一必須氨基酸的培養基上生長(cháng)。當誘餌和誘捕蛋白相互作用，Gal4反應性的His3表達促使細胞合成組氨酸并能在His缺陷培養基上生長(cháng)。
3） ADE2
Y2HGold菌株無(wú)法在不含腺嘌呤的基本培養基上生長(cháng)，但當兩個(gè)蛋白相互作用，Ade2表達被活化，細胞能在A(yíng)de缺陷的基礎培養基上生長(cháng)。
4） MEL1
MEL1編碼α-半乳糖苷酶，存在許多酵母菌內的天然表達蛋白。當雙雜交發(fā)生，MEL1表達和分泌，在底物X-α-Gal（貨號：M5831-100mg）存在的情況下，酵母菌落變?yōu)樗{色。
三、三個(gè)不同的結合位點(diǎn)（three different binding sites）
Y2HGold菌株三個(gè)啟動(dòng)子控制4個(gè)報告基因是不相關(guān)的，除UAS區域的短蛋白結合位點(diǎn)特異性結合Gal4 DNA-BD。因此，誘捕蛋白（文庫蛋白或靶蛋白）與UAS內部或邊緣的不相關(guān)序列作用（假陽(yáng)性）就會(huì )自動(dòng)被篩查出來(lái)。
Matchmarker酵母菌株的報告基因構造。Y2HGold中，HIS3，ADE2，MEL1，和AUR1-C報告基因分別由三個(gè)完全異源的Gal4反應啟動(dòng)元件-G1，G2，M1操控。而啟動(dòng)子內的蛋白結合位點(diǎn)是不同的，雖然每一個(gè)結合位點(diǎn)與Gal4識別的17-mer共有序列相關(guān)聯(lián)。
酵母雙雜交系統操作流程（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay為例）
完整的Matchmarker篩選過(guò)程包含以下步驟：
第一步：執行對照實(shí)驗；
第二步：誘餌載體的構建及自我激活和毒性檢測；
第三步：篩選Mate&Plate文庫
第四步：確認和闡釋結果
酵母雙雜相關(guān)產(chǎn)品：
貨號
產(chǎn)品
規格
單價(jià)/元
M1397
IPTG
10g
419
M6090
X-Gal
1g
426
M5831-100mg
X-α-Gal
100mg
1280
M5831-250mg
X-α-Gal
250mg
2199
S2705
MUG 4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸
250mg
680
S2805
MUG 4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸
1g
1780
M0129
Aureobasidin
A（AbA）金擔子素A （1mg/ml）
1mg
1378
M0135
Aureobasidin A （AbA）金擔子素A（凍干粉）
10mg
6800
M1405-1g
硫酸慶大霉素Gentamicin Sulfate Salt
1g
382
M1405-5g
硫酸慶大霉素Gentamicin Sulfate Salt
5g
1150
M8071
5-Fluoroorotic Acid (5-FOA) 5-氟乳清酸
1g
424
M8271
5-Fluoroorotic Acid (5-FOA) 5-氟乳清酸
5g
1524
M8471
5-Fluoroorotic acid monohydrate (5-FOA) 5-氟乳清酸一水合物
500mg
347
M8671
5-Fluoroorotic acid monohydrate (5-FOA) 5-氟乳清酸一水合物
1g
612
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