CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）系統是原核生物的獲得性免疫系統，用于抵御外源入侵的病毒或質(zhì)粒。2012 年，來(lái)自Ⅱ型CRISPR系的CRISPR相關(guān)蛋白Cas9被證明可以在體外由簡(jiǎn)單設計的向導RNA（single guide RNA，sgRNA）引導識別并切割含PAM（protospacer adjacent motif）序列的靶標雙鏈DNA ；快Cas9又被成功應用于哺乳動(dòng)物細胞的基因組編輯。從那時(shí)起，CRISPR技術(shù)在基因組編輯領(lǐng)域受到了高度重視和廣泛應用，也連續多年被Science雜志列為“年度十大技術(shù)破”。此外，CRISPR技術(shù)也被用于基因表達調控、高通量篩選、表觀(guān)遺傳學(xué)工程等領(lǐng)域。

      核酸檢測是病原菌檢測、疾病檢測、用藥指導等領(lǐng)域的重要技術(shù)。雖然，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了許多核酸檢測的方法，但更快速、更廉價(jià)、更特異、更靈敏的技術(shù)仍然是不斷追求的目標。CRISPR技術(shù)無(wú)疑提供了核酸檢測領(lǐng)域的新的解決方案，特別是基于Cas13和Cas12的反式切割（trans cleavage）或稱(chēng)附帶切割（collateral cleavage）的活性開(kāi)發(fā)的檢測技術(shù)被譽(yù)為“下一代分子快速診斷技術(shù)”。

基于Cas9 的檢測系統

      通過(guò)將Cas9的特異性切割特征和核酸擴增體系結合，可實(shí)現針對靶標核酸的檢測，從而可實(shí)現SNP（single nucleotide polymorphism）的區分和病原體表型的分型。目前，有至少3種結合PCR擴增的檢測方法被成功開(kāi)發(fā)，分別為ctPCR（CRISPR-typing PCR）、CARP（Cas9/sgRNAs-associated reverse PCR）和基于CRISPR/Cas9切割活性的PCR。上述方法都是在PCR擴增之前利用Cas9切割完全匹配的靶標序列，而不切割產(chǎn)生突變的靶標序列，從而影響PCR的擴增結果，進(jìn)而區分諸如高危人乳頭瘤病毒（HPV）亞型HPV16和HPV18或是用來(lái)檢測低頻突變。

      對于偏遠地區的野外檢測，常常需要無(wú)需精確循環(huán)控溫儀器的等溫擴增方法。結合NASBA（nucleic acid sequence based amplifi cation）介導靶標序列擴增，將Cas9、T7轉錄系統與基于紙質(zhì)載體的等溫toehold生物傳感系統相結合，可實(shí)現通過(guò)肉眼觀(guān)察來(lái)檢測寨卡病毒的基因分型。此外，CAS-EXPAR（CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction）和CRISDA（CRISPR-Cas9-triggered nicking endonuclease mediated strand displacement amplifi cation method）方法，都使用了Cas9的切割與等溫擴增相結合的策略，以達到針對靶標序列的單堿基分辨率。

基于反式切割活性的核酸檢測

單鏈RNA反式切割活性的核酸檢測系統

      Cas13a 是RNA引導的RNA切割酶，屬于Ⅵ型CRISPR-Cas 蛋白。在gRNA的引導下，Cas13a 結合單鏈靶標RNA后，除了能將靶標RNA切斷之外，還可激發(fā)Cas13a的“反式切割”活性，即Cas13a隨機切割體系中其他的單鏈RNA分子?；贑as13a的該原理，研究人員開(kāi)發(fā)了SHERLOCK（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing）的檢測系統。具體做法是利用RPA（recombinase polymerase amplification）或者RT-RPA等溫擴增系統將目標模板擴增為包含T7啟動(dòng)子的DNA模板，然后再利用T7轉錄系統把DNA模板轉變?yōu)镃as13a可以直接結合的RNA靶標；同時(shí)在體系中添加一端為熒光發(fā)光基團、一端為熒光淬滅基團的單鏈RNA報告分子；在Cas13a結合靶標RNA后即觸發(fā)Cas13a隨機切割單鏈RNA探針的活性，從而產(chǎn)生游離的熒光發(fā)光基團并發(fā)出可檢測的熒光。利用該方法，研究人員靈敏地檢測了各種DNA或RNA靶標，包括寨卡病毒、 登革熱病毒、細菌分離株、抗性基因、人類(lèi)DNA 基因型和癌癥突變等。之后不久， 第二代SHERLOCKv2 系統被成功開(kāi)發(fā)，其使用4 種正交的CRISPR-Cas 蛋白來(lái)實(shí)現多重靶標的檢測。在此基礎上，為了適應野外偏遠地區的快速分子檢測，研究人員進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了HUDSON（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases）方法來(lái)直接對人的體液進(jìn)行快速樣本處理，然后利用SHERLOCK 方法便在不到2h 內直接從患者樣本中成功檢測出了登革熱病毒。

單鏈DNA反式切割活性的核酸檢測系統

       除Cas13蛋白外， 來(lái)自Ⅴ 型的CRISPR-Cas12a蛋白也被發(fā)現具有反式切割特性；但與Cas13不同，Cas12a靶向DNA模板并反式切割單鏈DNA（singlestranded DNA，ssDNA）利用Cas12a蛋白建立的核酸快速檢測方法的首次報導來(lái)自一篇2017 年提交的中國專(zhuān)利；后來(lái)，同一研究組在線(xiàn)發(fā)表了兩篇研究論文，詳細描述了Cas12a的切割特征和基于Cas12a的核酸檢測方法，稱(chēng)為HOLMES（onehour low-cost multipurpose highly efficient system）。同一時(shí)期，美國一個(gè)研究組也發(fā)布了基于Cas12a的、類(lèi)似的核酸檢測方法，名為DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR transreporter）。無(wú)論是HOLMES還是DETECTR都展示了非常高效、靈敏和特異的檢測活性，可以用來(lái)快速檢測DNA病毒、RNA病毒和人的SNP。

本產(chǎn)品僅限科研研究不做臨床診斷