信使核糖核酸（mRNA）的5’端帽子結構（Five-prime cap）（m7GpppN）是在 1970 年代被發(fā)現的，它的存在賦予了mRNA穩定性并使其能夠有效翻譯。隨著(zhù)COVID-19在全球肆虐，mRNA治療成為生物醫藥研發(fā)領(lǐng)域中的”新星“，我們對mRNA 5’端帽子結構的生物功能及其應用有了更深入地探索。

      在真核細胞中，除了識別蛋白質(zhì)合成的起始之外，5’端帽子結構還充當從5’到3’外切核酸酶切割的保護基團，同時(shí)也是募集蛋白質(zhì)因子以進(jìn)行前體mRNA 剪接、聚腺苷酸化和核輸出的唯一標識符，它也充當募集起始因子的錨點(diǎn)。甚至，在病毒與固有免a疫的博弈中5’端帽子結構也極為重要。因為固有免疫系統對沒(méi)有 5 ’端帽子結構的 RNA 具有較高的敏銳度，因此很多病毒進(jìn)化出了豐富多樣的加帽策略。而對這些病毒mRNA的加帽機制研究，已拓展出諸如高效體外RNA 加帽系統和自擴增 mRNA 技術(shù)，大大促進(jìn)了科研型與治療型 mRNA 的大規模生產(chǎn)。另外，RNA 加帽酶的應用也使微生物轉錄組的測序和量化成為可能。

圖1. mRNA的分子生物學(xué)結構

        mRNA是指導蛋白質(zhì)合成的模板，是一種遺傳物質(zhì)的臨時(shí)副本，具有拷貝少、壽命短、修飾成分少的特點(diǎn)。成熟的真核生物mRNA的主體序列是編碼區（圖1），上游5’ 側和下游3’側的非編碼區分別包含帽子結構與poly(A)尾結構（圖2）。

       真核生物的mRNA加帽過(guò)程需要多種加帽酶的參與。如圖3所示，RNA三磷酸酶（TPase）從5’-三磷酸中去除 γ-磷酸，生成 5’-二磷酸 RNA（反應 1）。RNA 鳥(niǎo)苷酸轉移酶（GTase）通過(guò)賴(lài)氨酸-GMP 共價(jià)中間體將 GMP 基團從 GTP 轉移到 5’-二磷酸（反應 2.1 和 2.2）。嘌呤-N7 甲基轉移酶（鳥(niǎo)嘌呤-N7 MTase）在鳥(niǎo)嘌呤帽的N7胺上添加一個(gè)甲基，形成基本帽結構（Cap0）（反應 3）。

      此外，m7G 特異性 2’O-甲基轉移酶（mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase）還可將核糖2’O位置的核糖核苷酸甲基化生成Cap1結構（反應 4）。最近的研究表明，Cap1不僅與翻譯起始有關(guān)，在針對外源RNA的先天免疫系統中，還可作為自身RNA的標志。

      5’端帽子結構對mRNA的質(zhì)量控制有著(zhù)至關(guān)重要的作用。在哺乳動(dòng)物細胞中，已經(jīng)報道存在一種具有脫帽酶、焦磷酸水解酶和 5’ 到 3’核酸酶活性的三功能蛋白DXO/Dom3Z。該酶特異性地將未甲基化的帽子結構（GpppN）進(jìn)行脫帽處理并將其降解為5’-單磷酸RNA，從而達到質(zhì)量控制的目的。

      5’端帽子結構有助于調節蛋白質(zhì)合成。早期認為RNA加帽只發(fā)生在細胞核中，已有報道在哺乳動(dòng)物細胞和錐蟲(chóng)的細胞質(zhì)中發(fā)現了RNA 加帽。真核細胞在P-小體中以信使核糖核蛋白（mRNP）的形式維持未加帽結構的mRNA 細胞質(zhì)池，在那里可以發(fā)生 mRNA 的儲存、去腺苷酸化和脫帽。P-小體中未加帽的mRNA可以重新進(jìn)入多核糖體（polysome）并被翻譯。細胞質(zhì)重新加帽子結構的系統可能代表了一種新的mRNA 失活-再激活機制，有助于調節蛋白質(zhì)合成。

      鑒于RNA帽子結構在蛋白質(zhì)翻譯和固有免疫中有重要作用，病毒已經(jīng)進(jìn)化出RNA添加帽子結構的生物學(xué)系統，用于合成病毒蛋白質(zhì)和逃避宿主細胞的固有免疫系統。由于大部分細胞中RNA加帽的場(chǎng)所在細胞核中，因此在細胞質(zhì)中復制的病毒會(huì )產(chǎn)生自己的RNA帽子結構。它們是通過(guò)合成自己的RNA帽子結構或直接從宿主的mRNA中奪取。

      一些病毒加帽酶整合了RNA加帽所有必要酶活性（多功能加帽酶），以在單個(gè)多肽中生成Cap0或Cap1。痘病毒加帽酶和藍舌病病毒加帽酶就是這樣兩個(gè)例子，它們的全長(cháng)蛋白質(zhì)結構已經(jīng)被解析（圖4）：



       痘病毒加帽酶結構和生化數據表明，D12與鳥(niǎo)嘌呤-N7 MTase 結構域的相互作用會(huì )誘導有效催化所需的構象變化。痘病毒加帽酶的三種酶活性從N-端到C-端按照TPase、GTase和鳥(niǎo)嘌呤-N7 MTase的順序整齊排列為離散模塊。藍舌病毒加帽酶VP4 整合了所有4種酶活性以生成Cap1結構。

      病毒除了合成自身的帽子結構，也存在奪取宿主mRNA帽子結構的情況（圖5），在流感病毒（（-）ssRNA）中，依賴(lài)于RNA的RNA聚合酶（RdRp）是三種蛋白質(zhì)的復合物：聚合酶基礎蛋白1（PB1）、聚合酶基礎蛋白2（PB2）和聚合酶酸性蛋白（PA）。

      在細胞核中組裝后，PB2 亞基與宿主RNA 的帽子結構結合。PA的核酸內切酶將切割宿主mRNA的含帽子結構在內的10-15個(gè)核苷酸，然后將其用于病毒的mRNA轉錄上。在酵母全病毒中Gag蛋白從宿主RNA上切割 m7GMP 基團并形成組氨酰-m7GMP共價(jià)中間體。然后將 m7GMP 基團共轉錄轉移到病毒轉錄本的 5’-二磷酸上。該過(guò)程與經(jīng)典 GTase活性的相似性表明全病毒帽子結構與真核生物加帽機制之間存在進(jìn)化聯(lián)系。



病毒由于其特殊的添加mRNA帽子的方式而得到關(guān)注，人們也發(fā)現其RNA加帽酶具廣泛的應用價(jià)值：

1. 外源mRNA技術(shù)
作為蛋白質(zhì)合成的模板，將mRNA導入細胞是驅動(dòng)細胞內靶蛋白表達最直觀(guān)的方式。外源性mRNA在干細胞重編程、疫苗接種和治療性蛋白質(zhì)的表達中起到舉足輕重的地位。
2. 功能性mRNA的酶促合成
為避免攜帶動(dòng)物或病毒材料，最好在體外使用無(wú)動(dòng)物來(lái)源材料以酶促方式制造治療性RNA。通常，DNA依賴(lài)性RNA聚合酶將含有啟動(dòng)子的DNA模板轉錄成RNA。RNA的酶促加帽通常使用痘病毒加帽酶進(jìn)行，允許對RNA進(jìn)行完全加帽，產(chǎn)生帶有Cap0的RNA。
在固有免疫反應最小化的應用中，可以使用帽特異性2’O-甲基轉移酶將Cap0結構進(jìn)一步修飾為Cap1。在轉錄中分別使用m5CTP 和假尿苷三磷酸代替CTP和UTP已被證明可以減少TLR誘導的免疫反應。
3. mRNA疫苗
與傳統的減毒活完整生物體相比，通過(guò)mRNA接種進(jìn)行疫苗接種具有許多積極的屬性。mRNA疫苗不僅不會(huì )對載體產(chǎn)生免疫反應，是可以同時(shí)刺激固有免疫和體液免疫的有效手段。制造很簡(jiǎn)單，一旦獲得致病因子的基因組序列，就可以迅速做出反應。與DNA疫苗不同，抗原產(chǎn)生的反應時(shí)間更快、更有效，因為mRNA疫苗可以直接在細胞質(zhì)中翻譯。也無(wú)需擔心潛在的基因組整合。
4. 自擴增mRNA
利用甲病毒的RNA轉錄加帽裝置，已開(kāi)發(fā)出一種自擴增mRNA 技術(shù)作為疫苗接種的原位基因表達載體。甲病毒有一個(gè)（+）ssRNA 基因組，編碼非結構性前體蛋白nsp1-4，用于RNA依賴(lài)性RNA復制、轉錄和加帽，以及兩個(gè)衣殼蛋白E2和E1。
通過(guò)用目標基因替換衣殼蛋白基因，加帽和聚腺苷酸化的自擴增RNA 構建體在引發(fā)免疫反應方面比通過(guò)標準mRNA接種疫苗更有效，并且已經(jīng)在動(dòng)物模型中證明有效。
5. Cappable-Seq RNA測序
痘病毒加帽酶能夠使用3’修飾的GTP為RNA添加帽子結構。從而出現了一種基于這種功能的從生物樣品中富集和測定5’-三磷酸RNA 種類(lèi)的新方法。稱(chēng)為Cappable-seq，痘病毒加帽酶用于使用3’-脫硫生物素GTP 將生物樣品中RNA的5’-三磷酸或二磷酸末端加帽。然后可以對脫硫生物素化的加帽RNA進(jìn)行富集和深度測序。
Cappable-seq實(shí)現了50倍于初級轉錄本的富集，并在大腸桿菌中以單堿基分辨率在全基因組范圍內識別了以前未報告的轉錄起始位點(diǎn)（TSS）。該方法還被應用于從小鼠盲腸樣本中鑒定微生物組轉錄組，并首次在微生物組中鑒定出TSS。

目前現有的加帽方法:

1.酶學(xué)法mRNA加帽
牛痘病毒加帽酶將 7-甲基鳥(niǎo)苷帽結構（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5′ 末端。在真核生物中，該結構與 mRNA 的穩定、轉運和翻譯密切相關(guān)。這種系統通常含三種酶（RNA 三磷酸酶，鳥(niǎo)嘌呤轉移酶，鳥(niǎo)嘌呤甲基轉移酶）；都為加入完整 Cap 0 結構 m7Gppp5’N 所必需。近岸蛋白生產(chǎn)的加帽酶可用于 T7 RNA Polymerase, GMP Grade（GMP-E121，Novoprotein）反應產(chǎn)生的 RNA 的加帽反應，加帽反應在一小時(shí)之內完成，加帽效率接近 100％，并且所有帽結構均以正確的方向添加，這與共轉錄法添加帽類(lèi)似物不同。

2.帽結構類(lèi)似物共轉錄加帽
抗-反帽結構類(lèi)似物（ARCA）[抗-反帽結構類(lèi)似物 3’-O-Me-m7G（5’） ppp（5’）G] 是用于共轉錄加帽的首選帽結構類(lèi)似物。由于 ARCA 進(jìn)行共轉錄時(shí)為定向整合，N7-甲基鳥(niǎo)苷位于 [m7G（5’）pppG-RNA] 末端，因此能夠產(chǎn)生 100％ 可翻譯的帶帽轉錄本。

而標準帽結構類(lèi)似物 [標準帽結構類(lèi)似物 m7G（5’）ppp（5’） G] 能夠以?xún)煞N方向整合[m7G（5’）pppG-RNA]或[G（5 ’） pppm7G-RNA]，產(chǎn)生轉錄本為混合物。如果帽結構類(lèi)似物以錯誤的方向摻入 mRNA 則無(wú)法有效翻譯，從而導致目標蛋白產(chǎn)量低。如果 RNA 產(chǎn)物為 5’-加帽和 5’-三磷酸的混合轉錄產(chǎn)物，則需要將其進(jìn)行純化或使用磷酸酶處理，以避免 5’-三磷酸 RNA 產(chǎn)生的免疫原性。

3.Cap 1 修飾
已有研究表明 cap 1 結構能夠增強 mRNA 的翻譯效率，從而提高 mRNA 在轉染和顯微注射實(shí)驗中的表達。以近岸蛋白為例，其Cap 1 Capping System可利用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體，使加帽的 RNA（cap 0）甲基化，獲得 cap 1 結構。

綜上所述，mRNA的帽子結構與RNA質(zhì)量控制和機體固有免疫有重要聯(lián)系，與此同時(shí)，與加帽有關(guān)的病毒加帽相關(guān)酶類(lèi)也得到人們重視。加帽酶在外源mRNA技術(shù)、功能性mRNA的酶促合成、mRNA疫苗、自擴增mRNA和Cappable-Seq RNA測序方面都有較好的應用前景。

參考文獻：AnandRamanathan, G. Brett Robb, Siu-Hong Chan, mRNA capping: biological functions and applications, Nucleic Acids Research, Volume 44, Issue 16, 19 September 2016, Pages 7511–7526, https://doi.org/10.1093/nar/gkw551
文章來(lái)源：RNAScript

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