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    mRNA疫苗體外合成完整解決方案
          隨著(zhù)生命科學(xué)的不斷進(jìn)步,mRNA作為藥物被應用到疾病治療、疫苗等領(lǐng)域。從1990年體外合成的mRNA第一次在細胞內表達,到2020年的mRNA疫苗在對抗新冠疫苗發(fā)揮重要作用。以mRNA為基礎的治療方式已經(jīng)在醫藥領(lǐng)域引起了一場(chǎng)革命。
    mRNA(Messenger RNA、信使RNA)是將DNA中的基因信息傳遞到蛋白的中間信使。mRNA疫苗治療(見(jiàn)下圖)是指在體外合成mRNA,將其導入體內,mRNA進(jìn)入細胞后翻譯表達出抗原蛋白,抗原刺激體內免疫系統,激活體液免疫和細胞免疫,當機體再次接觸同種抗原(細胞/病毒),可產(chǎn)生快速免疫應答反應,自我保護。


           mRNA疫苗具有研發(fā)速度快、靈活、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、平臺化、容易擴充產(chǎn)能,可以用于精準化和個(gè)性化治療,一次可呈遞多種抗原等優(yōu)點(diǎn)。mRNA疫苗屬于第三代疫苗技術(shù)(見(jiàn)下圖),相比于傳統疫苗需要通過(guò)將病原微生物及其代謝產(chǎn)物通過(guò)人工滅毒﹑減活﹑基因工程的方法制成的繁雜工序,第三代疫苗特異性更強,有效性更高,并且研發(fā)周期較快。它的結構簡(jiǎn)單、可人工批量合成,并且可以在研發(fā)階段進(jìn)行高通量篩選,大大節省研發(fā)時(shí)間。而且相較于DNA疫苗,mRNA疫苗沒(méi)有導入外源基因的遺傳風(fēng)險,起效更快,效果更強。

    mRNA疫苗相對于其他疫苗的優(yōu)勢  圖片引用于網(wǎng)絡(luò )

           mRNA疫苗具有工藝通用性好,研發(fā)速度快,能夠活化細胞免疫,刺激效果好,遞送效果好等特性。高的mRNA產(chǎn)量需要高效的mRNA體外合成方法,大規模生產(chǎn)選擇T7 RNA聚合酶體外轉錄。增強mRNA的穩定性,降低免疫原性并提升翻譯效率,最有效的解決方案是:使用加帽酶對mRNA進(jìn)行加帽,使其在細胞內外穩定,降低免疫原性,并且使mRNA可以被核糖體識別,啟動(dòng)翻譯程序。

          近岸蛋白質(zhì)提供一系列mRNA體外合成酶及試劑,解決mRNA疫苗的關(guān)鍵痛點(diǎn)。所有產(chǎn)品均采用藥用規格原輔料生產(chǎn),嚴格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留及常見(jiàn)病原體污染,符合GMP規范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規程,保障生產(chǎn)過(guò)程及所有原輔料可追溯。


    產(chǎn)品特點(diǎn):
    GMP級mRNA體外合成及修飾原料,animal-free,ampicillin-free
    產(chǎn)品生產(chǎn)、質(zhì)量控制及配套文件體系,符合mRNA疫苗及藥物研發(fā)生產(chǎn)需求
    經(jīng)過(guò)臨床使用驗證,單批次產(chǎn)能千萬(wàn)人份,年產(chǎn)能50億人份
           
    mRNA疫苗體外合成關(guān)鍵步驟及相關(guān)產(chǎn)品:

    1、生成模板-質(zhì)粒線(xiàn)性化 相關(guān)產(chǎn)品:Bsa I,GMP Grade(貨號:GMP-RE026)
            此步將構建好的質(zhì)粒酶切,處理成線(xiàn)性化雙鏈DNA模板,用于下一步mRNA合成。
            限制性?xún)惹忻窧sa I 特異性識別雙鏈DNA中位點(diǎn)并進(jìn)行酶切,可將模板質(zhì)粒酶切線(xiàn)性化,作為mRNA體外合成模板;
            酶切位點(diǎn):

    產(chǎn)品特點(diǎn):
            強特異性
            受CpG、Dcm甲基化影響,剪切阻斷
            受EcoBI甲基化影響,剪切可能受影響
            不受Dam甲基化影響

    2、mRNA體外合成  相關(guān)產(chǎn)品:T7 RNA Polymerase, GMP Grade (貨號:GMP-E121)
           此步以DNA為模板,在體外由RNA聚合酶催化合成mRNA。
    T7 RNA Polymerase(T7 RNA聚合酶)是高度特異識別T7啟動(dòng)子序列的5'→3' RNA聚合酶,以含有T7啟動(dòng)子序列的單鏈或雙鏈DNA為模板,以NTP為底物,合成與啟動(dòng)子下游的單鏈DNA互補的RNA。T7 RNA聚合酶是體外轉錄mRNA的關(guān)鍵酶。


    產(chǎn)品特點(diǎn):
    高度特異識別T7啟動(dòng)子
    20ul反應體系,產(chǎn)量可達150ug
    可對低至1ng模板進(jìn)行有效轉錄
    合成長(cháng)度可達15k


    體外轉錄產(chǎn)生的mRNA,Qsep1結果顯示,純度高,均一性好。

    3、mRNA轉錄后修飾:加帽加尾
    此步對mRNA進(jìn)行修飾,合成功能完整的mRNA。



    完整mRNA結構
    3.1、mRNA加帽(Cap0)   相關(guān)產(chǎn)品:Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade (貨號:GMP-M062)        
          此步與3.2同時(shí)進(jìn)行,在mRNA的5'端加上Cap0帽結構。
    在真核生物中,轉錄后的mRNA必需經(jīng)過(guò)一系列修飾才能形成完整的結構,即在5'端形成一個(gè)帽子結構(Cap1),3’端形成PolyA尾結構。這些結構與mRNA的穩定、轉運和翻譯密切相關(guān)。
          Vaccinia Capping Enzyme(牛痘病毒加帽酶)用于給體外轉錄合成的mRNA催化加上帽子結構(Cap0),顯著(zhù)改善mRNA的穩定性和翻譯能力,使mRNA可在細胞內表達蛋白,避免核酸外切酶等的降解破壞。
          mRNA的帽結構是由一個(gè)7-甲基鳥(niǎo)苷通過(guò)一個(gè)5′–5′三磷酸酯橋連接到mRNA 鏈的5′核苷上組成。Cap-0結構由相鄰的RNA鏈通過(guò)三種酶的依次反應形成。進(jìn)一步形成cap-1結構需要2-O甲基轉移酶(Cat. No: GMP-M072, Novoprotein)參與,該修飾可以降低RNA在體內引起的細胞先天免疫反應。

    產(chǎn)品特點(diǎn):
    高效完成mRNA加帽Cap0   
    提高mRNA的穩定性,防止被RNA酶降解                                                           
    提高mRNA的翻譯效率,提高蛋白產(chǎn)量

    3.2、mRNA加帽(Cap1)  相關(guān)產(chǎn)品:mRNA 2’-O-Methyltransferase, GMP Grad e (貨號:GMP-M072)
           此步與3.1同時(shí)進(jìn)行,在mRNA的5'端加上Cap0帽結構的基礎上,再將Cap0轉化為Cap1結構。
           真核生物中,mRNA的轉錄后須經(jīng)系列修飾,在5'端形成一個(gè)特殊結構,即帽子結構,3’端形成PolyA尾結構。這些結構與mRNA的穩定、轉運和翻譯密切相關(guān)。已知Cap1結構存在于所有真核生物mRNA,在穩定mRNA結構和提高翻譯效率方面起重要作用。研究表明,體外轉錄修飾得到的Cap1結構mRNA更不容易被免疫系統的RNA感受器(RIG-I)識別,因此免疫刺激更低。
           mRNA Cap 2′-O-Methyltransferas (2′-O-甲基轉移酶)可利用 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體, 在 RNA 5′末端緊鄰帽結構(Cap 0)的第一個(gè)核苷酸的 2′-O 上添加甲基基團,形成帶有 Cap 1 結構的 mRNA。Cap1 結構能增強 mRNA 的翻譯效率,從而可提高轉染后 mRNA 編碼的蛋白表達水平。該酶只能以帶 7-甲基鳥(niǎo)苷帽結構(m7GpppN)的 RNA 為底物,不會(huì )作用于 5′末端為pN、ppN、 pppN 或 GpppN 的 RNA。帶 7-甲基鳥(niǎo)苷帽結構(m7GpppN)的 RNA 可通過(guò) Vaccinia Capping System(Cat. No: GMP-M062, Novoprotein)來(lái)制備。

    產(chǎn)品特點(diǎn):
    使mRNA的Cap 0帽子甲基化為 Cap 1帽子
    提高 RNA 的翻譯效率,提高蛋白產(chǎn)量
    進(jìn)一步降低免疫原性


    完整mRNA在細胞內表達GFP蛋白,加帽酶與帽類(lèi)似物對比

    3.3、mRNA加尾(PolyA)  相關(guān)產(chǎn)品:E. coli Poly(A) Polymerase, GMP Grade (貨號:GMP-M012)
          此步在mRNA的3'端加上PolyA尾。
          真核生物中,mRNA的轉錄后須經(jīng)系列修飾,在5'端形成一個(gè)特殊結構,即帽子結構,3’端形成PolyA尾結構。這些結構與mRNA的穩定、轉運和翻譯密切相關(guān)。Poly A與成熟mRNA的穩定性、翻譯起始以及出核運輸有關(guān),體內轉錄后修飾中,polyA聚合酶在RNA 3’-OH上逐一引入100-200個(gè)A堿基。
    體外轉錄RNA過(guò)程中,E. coli Poly (A) Polymerase(加尾酶) 不依賴(lài)模板的存在,可以催化 ATP 以 AMP 的形式依次摻入到 RNA 的 3′末端,即在 RNA 的 3′末端加多聚 A 尾。Poly (A) 聚合酶具有很高的加尾效率,可以在 RNA 的 3′末端加入 20~200 個(gè) A 堿基。最大程度還原體內加尾過(guò)程。
    產(chǎn)品特點(diǎn):
    穩定mRNA的存在形式
    引導轉錄終止
    提高RNA在真核細胞中的翻譯效率

    4、其他相關(guān)產(chǎn)品
    4.1、防止mRNA降解  相關(guān)產(chǎn)品:RNase inhibitor, GMP Grade (貨號:GMP-E125)
    在流程2-3 mRNA合成與修飾中加入RNase Inhibitor,防止RNA降解。
    RNase Inhibitor可與RNase  A形成1:1復合體,對RNase 有極強非競爭性抑制,保護mRNA轉錄后不被降解
    產(chǎn)品特點(diǎn):
    強抑制RNase活性
    穩定性強

    4.2、降解模板DNA  相關(guān)產(chǎn)品:DNase I, GMP Grade (貨號:GMP-E127)
            在流程2 RNA合成結束后,去除模板DNA。
    DNase I將單鏈或雙鏈DNA隨機分解。


    DNase I 去除RNA樣本種的DNA殘留

    4.3、增加mRNA產(chǎn)量  相關(guān)產(chǎn)品:Pyrophosphatase, Inorganic (yeast), GMP Grade (貨號:GMP-M036)
            在流程2 RNA合成過(guò)程中加入無(wú)機焦磷酸酶,增加RNA產(chǎn)量。
            無(wú)機焦磷酸酶PPase(Pyrophosphatase, Inorganic)可催化無(wú)機焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽(P2O7-4+H2O+PPase→2HPO4-2),一方面可去除無(wú)機焦磷酸鹽對反應體系的抑制,另一方面為反應提供熱力學(xué)動(dòng)力,促進(jìn)產(chǎn)物的生成。常用于RNA、DNA、蛋白質(zhì)的生物合成中,是一種良好的輔劑,在mRNA疫苗體外大規模合成中加入可顯著(zhù)提高產(chǎn)量。

     
    無(wú)機焦磷酸酶去除mRNA合成過(guò)程中產(chǎn)生的焦磷酸,提高mRNA產(chǎn)量

    轉載來(lái)源:RNAScript
    原文:近岸蛋白質(zhì)網(wǎng)站 Fr. https://www.novoprotein.com.cn/Cn/product/inproducts/id/536/catid/38.html


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