應用于重組蛋白純化檢測一一PA標簽系統_南京沃博生物科技有限公司

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應用于重組蛋白純化檢測一一PA標簽系統

瀏覽：486 發(fā)布日期：2022-08-13 11:48:55

PA-Taq新型親和標簽系統（日本wako）是利用單克隆抗體（NZ-1）識別肽標簽（GVAMPGAEDDVV）的高親和性&高特異性的親和純化標簽系統。PA tag 系統的親和性特異性?xún)?yōu)于現有標簽系統，抗體微珠可再生40-60次，可用于免疫細胞化學(xué)、免疫印跡和流式細胞術(shù)，是動(dòng)物宿主細胞重組蛋白生產(chǎn)中的有效工具。

◆特點(diǎn)

●　通過(guò)樹(shù)脂再生，降低運行成本

●　超高親和性抗體，實(shí)現高回收率、高純度純化

●　在動(dòng)物細胞表達系（HEK293T細胞、CHO細胞等）中，有效純化蛋白

● PA標簽系統是使用可識別肽標簽（12個(gè)氨基酸殘基）的單抗（NZ-1）。日本開(kāi)發(fā)的親和性純化標簽系統。

● NZ-1單抗對PA tag具有高親和性和特異性，可應用于Western Blotting、細胞流式分析、免疫組化（ICC）。

通過(guò)免疫沉淀，可純化PA標簽融合蛋白以及樹(shù)脂再生。

● PA標簽系統，可一步純化高純度PA標簽融合蛋白。

◆PA標簽系統

Fujii, Y. et al., "PA tag: A versatile protein tagging system using a super high affi nity antibody against a dodecapeptide derived from human podoplanin.", Protein Exp. Purif., 95, 240-247(2014).

Fujii, Y. et al.
新型親和標簽系統“PA tag”的應用方法~蛋白的純化及檢測~　蛋白科學(xué)學(xué)會(huì )檔案, 7, e075 (2014)

◆PA標簽表達載體案例

載體	表達模式	宿主細胞	MCS啟動(dòng)子
pCAG	瞬時(shí)表達	靈長(cháng)類(lèi)（人、猴）、犬細胞等粘著(zhù)細胞和嚙齒動(dòng)物細胞	CAG

◆用PA標簽從培養上清中親和提純的案例

數據提供：大阪大學(xué) 蛋白研究所附屬蛋白分析先進(jìn)研究中心

分子創(chuàng )制學(xué)研究室高木淳一老師，藤井勇樹(shù)老師

◆Protocol目的蛋白的純化

１．哺乳類(lèi)動(dòng)物細胞轉染(HEK293T)
轉染處于40-60%融合狀態(tài)的細胞
培養基：D-MEM, 5%FBS

２．回收培養上清和吸附蛋白樹(shù)脂
轉染48-72小時(shí)后，回收約420 mL培養上清，加入8 mL抗PA標簽抗體瓊脂糖珠，混合2小時(shí)（2-10℃）

３．樹(shù)脂回收
用50 mL的純化柱?；厥詹襟E2)中的瓊脂糖珠

４．樹(shù)脂洗滌
加入珠4倍量的TBS 緩沖液（20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl），清洗5次

５．PA標簽肽從樹(shù)脂中競爭性洗脫
加入經(jīng)1×TBS溶液, pH 7.5溶解過(guò)的PA 標簽肽（終濃度0.1 mg/mL），體積量需為珠的一倍，

然后分10次回收PA標簽融合蛋白X

６．SDS-PAGE
樣品量
c. sup：5 μL, flow through：5 μL, wash：5 μL,
肽洗脫（1-10）：各10 μL

可純化PA標簽融合蛋白X且不依賴(lài)PA標簽?！蓪?shí)現極高純度的親和純化。

◆通過(guò)PA tag降低背景的方法

M: Marker
I: input 100ng分
P: 純化前樣品
1: wash片段①
2: wash片段②
3: wash片段③
4: wash片段④
5: wash片段⑤
6: wash片段⑥
7: wash片段⑦
8: wash片段⑧
9: wash片段⑨
10: 酸洗脫①
11: 酸洗脫②
12: 酸洗脫③
13: 酸洗脫④
14: 酸洗脫⑤

在20 mL的昆蟲(chóng)細胞溶解液中加入蛋白Z，使其濃度變?yōu)?span>1.0 mg/L后，添加200 μL抗PA標簽抗體瓊脂糖珠，4℃溫度條件下，攪拌3小時(shí)。

分別用不同濃度的TBS溶液（0.15 M、0.5 M、1.0 M NaCl）進(jìn)行調整，用瓊脂糖珠50倍量清洗。在回收的各珠中加入0.5 mL 0.1 M Glycine-HCl(pH 2.7)，室溫條件下平穩震動(dòng)5 min。

離心后回收上清，用1 M Tris-HCl (pH 9.0)做中和處理。

SDS-PAGE后進(jìn)行銀染，比較去除污染蛋白之后，不同濃度下的結果。

◆使用案例：Western Blotting

地域革新領(lǐng)域加藤幸成老師，金子美華老師

NZ-1顯示出與天然抗體具有相同的高檢測靈敏度。

Lane 1

一抗：抗IDH1抗體（RcMab-1）, 1 μg/mL

二抗：抗大鼠IgG-HRP標簽, 1000倍稀釋

Lane 2

一抗：抗PA tag抗體, 1 μg/mL

二抗：抗大鼠IgG-HRP標簽, 1000倍稀釋

Lane 3

一抗：抗DYKDDDDK標簽抗體, 3.5 μg/mL

二次抗體：抗小鼠IgG-HRP標簽, 1000倍稀釋

樣品量：各10 μg
曝光時(shí)間：10分鐘

◆PA標簽系列

產(chǎn)品名稱(chēng)	子類(lèi)克隆號	適用實(shí)驗	規格	產(chǎn)品編號	包裝
單抗
抗PA標簽, 大鼠單抗 Anti PA tag, Rat Monoclonal Antibody	大鼠IgG2a NZ-1	IP, WB, FCM, ICC	免疫化學(xué)用	016-25861	200 μL
				012-25863	1 mL
HRP標簽單抗
抗PA標簽, 大鼠單抗,過(guò)氧化酶結合 Anti PA tag, Rat Monoclonal Antibody, Peroxidase Conjugated	大鼠IgG2a NZ-1	WB	免疫化學(xué)用	015-25951	200 μL
				011-25953	1 mL

產(chǎn)品名稱(chēng)	子類(lèi)克隆號	規格	產(chǎn)品編號	包裝
抗體結合瓊脂糖珠
抗PA標簽抗體瓊脂糖珠 Anti PA tag Antibody Beads	大鼠IgG2a NZ-1	免疫化學(xué)用	012-25841	2 mL(Net 1 mL)
			018-25843	10 mL (Net 5 mL)
			016-25844	50 mL (Net 25 mL)
識別N端、C端的PA標簽使用載體：4% 瓊脂糖溶液組成：1 x PBS (pH7.2), 0.05 w/v%疊氮化鈉抗體結合量：參見(jiàn)標簽記載結合容量：1 mL本品可結合約0.015-1.0 mg的PA標簽融合蛋白
抗體結合磁珠
MagCaptureTM HP 抗PA標簽抗體磁珠 MagCapture? HP Anti PA tag Antibody Magnetic Beads	大鼠IgG2a NZ-1	免疫化學(xué)用	137-18751	2 mL
溶液組成：1×TBS(pH 7.4), 50% glycerol, 0.05 w/v% sodium azide

產(chǎn)品名稱(chēng)	備注	規格	產(chǎn)品編號	包裝
肽
PA標簽肽 PA tag Peptide	含量（HPLC）95%以上	基因研究用	167-25501	5 mg
PA標簽肽 PA tag Peptide	含量（HPLC）95%以上	基因研究用	163-25503	25 mg
清洗溶液
PA標簽清洗溶液 PA tag Washing Solution	已過(guò)濾消毒即用型	基因研究用	169-27261	50 mL

產(chǎn)品名稱(chēng)	可選Marker		產(chǎn)品編號	包裝
產(chǎn)品名稱(chēng)	大腸桿菌	動(dòng)物細胞	產(chǎn)品編號	包裝
瞬時(shí)載體
pCAG-Ble PA 標簽-C pCAG-Ble PA tag-C	Bleomycin		161-26861	20 μg
pCAG-Ble PA 標簽-N 信號增加型 pCAG-Ble PA tag-N Signal Plus	Bleomycin		168-26871	20 μg
pCAG-Bsd PA 標簽-C pCAG-Bsd PA tag-C	Blasticidin S		165-26881	20 μg
pCAG-Bsd PA 標簽-N 信號增加型 pCAG-Bsd PA tag-N Signal Plus	Blasticidin S		162-26891	20 μg
pCAG-Neo PA 標簽-C pCAG-Hyg PA tag-C	Hygromycin B		165-26901	20 μg
pCAG-Hyg PA 標簽-N 信號增加型 pCAG-Hyg PA tag-N Signal Plus	Hygromycin B		162-26911	20 μg
pCAG-Neo PA 標簽-C pCAG-Neo PA tag-C	Kanamycin	G418	169-26921	20 μg
pCAG-Neo PA 標簽-N 信號增加型 pCAG-Neo PA tag-N Signal Plus	Kanamycin	G418	166-26931	20 μg

◆相關(guān)產(chǎn)品

內參照

下表為Western Blot實(shí)驗中參照用單抗一覽表。

產(chǎn)品名稱(chēng)	規格	產(chǎn)品編號	包裝
抗β肌動(dòng)蛋白單抗 Anti β-Actin, Monoclonal Antibody	免疫化學(xué)用	013-24553	200 μg
		011-24554	1 mg
		017-24556	5 mg
抗β肌動(dòng)蛋白單抗,過(guò)氧化物酶標記 Anti β-Actin, Monoclonal Antibody, Peroxidase Conjugated	免疫化學(xué)用	017-24573	200 μL
抗α-微管蛋白, 單抗 Anti α-Tubulin, Monoclonal Antibody	免疫化學(xué)用	011-25034	10 μg
		017-25031	200 μg
		013-25033	1 mg
Anti β-Tubulin, Monoclonal Antibody 抗β-微管蛋白, 單抗	免疫化學(xué)用	018-25044	10 μg
		014-25041	200 μg
		010-25043	1 mg
Anti GAPDH, Monoclonal Antibody 抗GAPDH, 單抗	免疫化學(xué)用	016-25523	200 μg
		014-25524	1 mg
		010-25526	5 mg
Anti GAPDH, Monoclonal Antibody, Peroxidase Conjugated 抗GAPDH, 單抗, 過(guò)氧化酶結合	免疫化學(xué)用	015-25473	200 μL

蛋白酶抑制劑系列

產(chǎn)品名稱(chēng)	規格	產(chǎn)品編號	包裝
蛋白酶抑制劑混合物試劑盒 I，無(wú)動(dòng)物源成分（通用型） Protease Inhibitor Cocktail Set I, Animal-derived-free (for general use) (×100), Lyophilized	通用型	165-26021	1 mL用
	通用型	161-26023	1 mL用×5
蛋白酶抑制劑混合物試劑盒III, DMSO溶液（不含EDTA）（×100） Protease Inhibitor Cocktail Set III, DMSO Solution (EDTA free) (×100)	動(dòng)物細胞	163-26061	1 mL
	動(dòng)物細胞	169-26063	1 mL×5
蛋白酶抑制劑混合物試劑盒V （無(wú)EDTA）（×100） Protease Inhibitor Cocktail Set V (EDTA free) (×100), Lyophilized	2D電泳	162-26031	1 mL
	2D電泳	168-26033	1 mL×5
蛋白酶抑制劑混合物試劑盒 VI，DMSO溶液，用于植物（×100） Protease Inhibitor Cocktail Set VI, DMSO Solution (for Plant) (×100)	植物細胞	164-26091	1 mL
	植物細胞	160-26093	1 mL×5
蛋白酶抑制劑混合物試劑盒VII，DMSO溶液，組氨酸標簽蛋白（×100） Protease Inhibitor Cocktail Set VII, DMSO Solution (for Histidine-tagged Protein) (×100)	His Tag 純化^※	167-26101	1 mL
	His Tag 純化^※	163-26103	1 mL×5

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