膠原誘導關(guān)節炎（CIA）首次應用是用Ⅱ型膠原免疫Wistar(遠親雜交)、Sprague-Dawley(遠親雜交)和Wistar-Lewis (近交) 中誘導成功。由于此CIA模型具有與人風(fēng)濕病關(guān)節炎（RA）相同的免疫和病理特征，因此該模型先后擴展到小鼠及非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物，并已作為人類(lèi)關(guān)節炎研究的廣泛應用的模型。然而，對于CIA模型來(lái)說(shuō)，不同種屬動(dòng)物之間是有差異的。小鼠對CIA的敏感性與主要組織相容性復合體（MHC）相關(guān)，在小鼠品系中只有DBA/1(H-2q)和B10.RⅢ(H-2r)兩個(gè)品系對CIA敏感。大鼠對CIA的敏感性也與MHC相關(guān)，并與小鼠相比具有較寬的品系范圍。因此，不同MHC型的不同品系的大鼠，盡管關(guān)節炎的發(fā)病率、嚴重程度及抗體和T-cell 的特異性在不同品系間不同，但都能夠誘發(fā)關(guān)節炎。

動(dòng)物的管理與飼養

       動(dòng)物必須是7-8 周齡健康的并在SPF條件下飼養的動(dòng)物。一般來(lái)說(shuō)，對于腸道菌群，不管是否致病都顯著(zhù)影響宿主對抗原的免疫應答。無(wú)菌的大鼠對佐劑誘發(fā)的關(guān)節炎高度易感（AIA），其次是SPF級大鼠及一般大鼠敏感性相對較低。即使同一品系,CIA 的發(fā)病率及嚴  重程度也有顯著(zhù)差異，這種差異是由于飼養條件造成的。

眾所周知，小鼠的飲食影響  CIA的發(fā)病率及嚴重程度。然而在大鼠在中沒(méi)有進(jìn)行廣泛研究。與小鼠相比，大鼠對Ⅱ型膠原的免疫應答更快且較短時(shí)間內能誘發(fā)關(guān)節炎，因此飲食對小鼠來(lái)可能不是影響關(guān)節炎的重要因素。然而，像小鼠一樣，飼以高脂肪的食物對誘發(fā)關(guān)節炎更有利。

大鼠的品系

       對Ⅱ型膠原的免疫應答以及關(guān)節炎的進(jìn)展與MHCRT1位點(diǎn)相關(guān)而且用于免疫的Ⅱ型膠原的動(dòng)物來(lái)源不同也會(huì )造成大鼠對Ⅱ型膠原的免疫應答以及關(guān)節炎的進(jìn)展上的差異。然而，與小鼠相比，很多品系的大鼠對CIA敏感，并能誘發(fā)一定程度的關(guān)節炎。一般來(lái)說(shuō)，豬的Ⅱ型膠原是最好的致炎膠原其后是牛的二型膠原，雞的二型膠原致炎性最差。以下大鼠品系是已明確的對CIA高度易感的品系：BB/DR (RT1u),Wistar Furth, LOU (RT1u), OM (RT1u)和 LEW (RT11) 大鼠。

       動(dòng)物質(zhì)量也很重要。在這方面，腸道菌群可能是影響機體對二型膠原免疫應答和關(guān)節炎進(jìn)展的重要影響因素之一。例如:Lewis 大鼠對CIA高度易感，同時(shí)發(fā)病率和炎癥嚴重程度都很高。但是同是SPF級Lewis 大鼠對CIA的敏感性由于年齡、飼養條件及免疫腸道菌而對CIA的敏感性存在顯著(zhù)差異。MDP(胞壁酰二肽)對加強Lewis 大鼠對CIA的發(fā)病率和嚴重程度非常有效。但是我們建議在用Lesis 大鼠造模之前先進(jìn)行小規模試驗，據我們所知BB大鼠是用于CIA造模最好的品系。 DA大鼠對CIA的敏感，但是同時(shí)AIA（佐劑誘發(fā)的關(guān)節炎）及礦物油誘發(fā)的關(guān)節炎（僅礦物油）高度敏感，因此不推薦用于CIA的造模。

備注：

1.與小鼠相反大鼠對同源（大鼠）Ⅱ型膠原是敏感的，同時(shí)誘發(fā)和猴一樣的關(guān)節炎。

2. 與小鼠和猴子相反，大鼠對Ⅱ型膠原抗體是針對Ⅱ型膠原分子構象的特異性抗體。因此膠原變性或免疫Ⅱ型膠原的單獨CB肽段都不能在大鼠中致炎。

膠原

       因為去糖基化的膠原會(huì )影響關(guān)節炎的產(chǎn)生，同時(shí)一些未去除的雜質(zhì)比如：胃蛋白酶可能會(huì )導致T細胞刺激試驗中產(chǎn)生假陽(yáng)性，因此Ⅱ型膠原應按規定高度純化。如果按恰當的方法凍干的膠原-20℃避光保存的條件下，是非常穩定的。純化的膠原溶于0.05M濃度的醋酸中，終濃度為2-4mg/mL，溫和攪拌，4℃過(guò)夜。膠原溶液在4℃保存一周，此后需在-20℃保存。Chondrex 公司提供較完整的不同免疫級別的Ⅱ型膠原。（見(jiàn)表1）

乳劑的制備

1）由于大鼠通常對佐劑誘發(fā)的關(guān)節炎（AIA）是敏感的，因此必須使用不完全佐劑（IFA）,貨號是7002。乳劑的質(zhì)量是能否誘發(fā)關(guān)節炎高發(fā)病率的關(guān)鍵因素。乳劑的制備有多種方法。但是不推薦注射器或超聲波處理的方法。這些方法將導致乳劑不能夠有效的、穩定的誘發(fā)關(guān)節炎。此外，超聲波處理方法，至少將膠原分成2個(gè)片段，這些小片段在正常體溫下，很容易變性。推薦使用電動(dòng)的高速攪拌器：

用高速攪拌器（帶直徑≤5mm的刀片，Fig.1）攪拌不完全佐劑（IFA）和膠原溶液(Fig 2a)。如果刀片夠不到注射器低端，可以把5mL或10mL的注射器從活塞處剪去一半（Fig.2b）。把注射器夾緊，固定在鐵架臺上，并冰浴。最后一步很重要，因在攪拌過(guò)程中會(huì )發(fā)熱，會(huì )引起蛋白變性，變性的蛋白不能夠誘發(fā)關(guān)節炎（CIA）。

Fig1. 高速攪拌器Fig2 刀片，截斷的注射器，漢密爾頓玻璃注射器

Fig. 截斷的注射器，支架上固定，冰浴

2) 加1體積（最多2.5mL）不完全完全佐劑到注射器，再加等體積的膠原溶液（0.05M醋酸溶解的的膠原溶液，終濃度2mg/mL），邊低速攪拌邊滴入膠原溶液。

3) 繼續混合，直到在最大轉速產(chǎn)生穩定的乳液（轉速約３0０００rpm/2-3 min）。在再次混合前確保乳液是冰浴中。對于大體積（2-5Ml）為了使乳液混合均勻，建議在混勻過(guò)程中移動(dòng)攪拌位置。

 注：可能需重復攪拌2-3次

4) 將一滴乳劑滴與一燒杯水中，檢測乳劑的穩定性。如果乳劑是穩定的，在水中是成團的，不散開(kāi)。

 注：如果乳劑在水面散開(kāi)，表明乳劑不穩定。再加幾滴佐劑，重新混合后，再檢測。

5)將乳劑轉移到1mL Hamiton 玻璃注射器。不加建議采用塑料注射器，因為很難做到一個(gè)準確的注射劑量。

注1：通過(guò)用力甩注射器將乳劑中的氣泡趕出注射器（活塞部向下）。否則很難做到一個(gè)精確的注射劑量。

注2：建議在乳劑制備好的一小時(shí)內，注射完畢。乳劑在在用前一直保持4℃。

注射部位

在鼠尾根部注射0.2mL(膠原：200μg)乳劑（Fig.4）。例如：從尾根部50px處插入針頭，直到針尖插入位置距尾根部0.5cm。針插入皮下且每次注射充分擦拭，防止乳液的露出。針頭沿斜向上與鼠尾方向平行插入。如果要加強免疫，注射部位在尾根部3Cm處，針尖插入皮下?lián)笪哺?.5cm處。

注1：背部皮下注射也非常有效，但需注射更多的膠原乳劑（0.5-1ml）。

注2：無(wú)論如何，我們不建議背部皮下注射或腹腔注射膠原乳劑和佐劑，如初次免疫或加強免疫。因為不完全佐劑在腹膜和腹腔引起嚴重的炎癥反應。

免疫程序

Ⅱ型膠原的自身IgG抗體水平及其亞型（可激活補體），對關(guān)節炎發(fā)生很重要。依據實(shí)驗目的有很多種方法可誘發(fā)高發(fā)病率的關(guān)節炎。

a.  通過(guò)單次免疫（無(wú)加強免疫）誘發(fā)關(guān)節炎

依據說(shuō)明書(shū)方法制備乳劑（膠原-不完全佐劑）和免疫，由于不同品系的的敏感性的差異，一般在2-3周可誘發(fā)關(guān)節炎。在一些免疫應答較強的品系，發(fā)病率達到80-90%。對于一些高度易感品系如BB大鼠，關(guān)節炎嚴重程度，臨床評分可達到10-12分（最高16分）。

b 通過(guò)加強免疫誘發(fā)關(guān)節

為了確保關(guān)節炎的發(fā)病率和嚴重度，可在初次免疫7天后加強免疫。按說(shuō)明書(shū)方法，準備膠原-不完全佐劑，尾部皮下注射0.1mL,會(huì )短時(shí)間內產(chǎn)生嚴重的關(guān)節炎。

按要求制備膠原+IFA 乳劑（1：1）

初次免疫(0day) ：200 ul乳劑/只

加強免疫（7day）：100ul 乳劑/只

關(guān)節炎的發(fā)生

于小鼠相比（約4周），關(guān)節炎在大鼠中產(chǎn)生的更快，初次免疫后，2-3周出現關(guān)節腫脹。在BB大鼠發(fā)生關(guān)節炎的時(shí)間比其它品系更快，約12-14天。如果免疫有效，3周后100%發(fā)生關(guān)節炎。

臨床評分

關(guān)節炎可通過(guò)臨床評分來(lái)定性評估或用測厚儀來(lái)測量爪子厚度來(lái)評估。這些方法適用于所有的關(guān)節炎模型比如經(jīng)典的CIA，佐劑誘導的關(guān)節炎和棉線(xiàn)誘導的關(guān)節炎。

                                                      表2  關(guān)節炎炎癥程度的臨床評分