PE(藻紅蛋白，Phycoerythrin)是從紅藻中分離出來(lái)的240 kDa 藻膽蛋白。它發(fā)出強烈的黃橙色熒光（比熒光素亮約 25 倍），摩爾消光系數為 1,960,000 cm -1 M -1，熒光量子產(chǎn)率為 0.84。天然狀態(tài)下的 PE 熒光光譜具有三個(gè)吸光度峰，一個(gè)主吸光度峰位于 565 nm，兩個(gè)次級吸光度峰位于 496 nm 和 545 nm，一個(gè)發(fā)射峰位于 574 nm。這三個(gè)吸光度峰提高了與配備藍色 (488 nm)、綠色 (532 nm) 和黃色激光 (561-568 nm) 的成像儀器的兼容性。

在使用PE之前，必須先將其與具有生物特異性的分子（例如抗體、鏈霉親和素或膜聯(lián)蛋白V）結合。PE和PE串聯(lián)結合物通常用于流式細胞術(shù)、微陣列和 ELISA，由于其快速光漂白特性，在免疫熒光顯微鏡中的用途有限。

圖1.PE的熒光光譜

R-PE（R-藻紅蛋白，R-Phycoerythrin）是一種特殊類(lèi)型的藻紅蛋白，其主要吸收峰在 565 nm，次要吸收峰在496和545 nm。不同物種的 R-PE 中次要吸收峰的相對突出程度存在很大差異。PE 有三種亞基：α（20KDa）、β（20KDa）和γ（30KDa）。R-PE的α亞基僅包含藻紅蛋白 (PEB) 發(fā)色團，而β和γ亞基則同時(shí)包含PEB和藻尿蛋白 (PUB)。不同物種的 PE 吸收光譜的變化反映了亞基的 PEB/PUB 比率的差異。R-PE和密切相關(guān)的B-PE 是熒光最強烈的藻膽蛋白，量子效率可能超過(guò)90%，并且其橙色熒光在任何中等濃度的溶液中都可以用肉眼輕易看到。

圖2.RPE的熒光光譜

 #AAT PE&R-PE的優(yōu)點(diǎn)

長(cháng)波長(cháng)發(fā)射曲線(xiàn)最大程度地減少了生物材料的自發(fā)熒光

藻膽素與蛋白質(zhì)骨架共價(jià)結合，導致熒光猝滅最小

水溶性極高，有利于結合反應的化學(xué)操作

顯著(zhù)的Stokes位移和可解析的發(fā)射光譜，適用于流式多色分析

多個(gè)位點(diǎn)可與抗體、花青染料或iFluor ^?染料等有機和合成化合物穩定結合

用于多色流式細胞術(shù)的串聯(lián)染料——使用單一激發(fā)光產(chǎn)生一系列發(fā)射信號。

圖3.頂部）使用4激光光譜流式細胞儀生成光譜圖。使用空間偏移激光器（355 nm、405 nm、488 nm 和 640 nm）創(chuàng )建四個(gè)不同的發(fā)射曲線(xiàn)，然后組合起來(lái)產(chǎn)生整體光譜特征。

底部）用 PE 抗人 CD4 *SK3* 偶聯(lián)物染色的 PBMC 的流式細胞術(shù)分析。使用 Aurora 光譜流式細胞儀在PE特異性 B6-A 通道中監測熒光信號。

PE串聯(lián)染料是由兩種不同的共價(jià)連接的熒光團組成，一個(gè)供體（例如R-PE）和一個(gè)發(fā)射較長(cháng)波長(cháng)熒光的受體（例如 Cy5 ^?、Cy7 ^?或 iFluor ^? 647）。在流式細胞術(shù)中，串聯(lián)染料非常適合細胞的多色參數分析。圖4說(shuō)明了FITC、PE、PE-Cy5 ^?和PE-Cy7 ^? 的出色光譜分離，無(wú)需大量補償即可實(shí)現細胞的四色分析。此外，所有四種熒光團都能被 488 nm 氬離子激光同時(shí)有效激發(fā)。

圖4.FITC（綠色）、PE（黃色）、PE-Cy5 ^?（橙色）和 PE-Cy7 ^?（紅色）的吸收和發(fā)射光譜表明，它們具有清晰的光譜分離，可以對細胞進(jìn)行四色分析。所有四種熒光團均被 488 nm 氬激光線(xiàn)（藍色）有效激發(fā)。FITC 可使用 FITC 濾光片組進(jìn)行可視化。PE 可使用 Cy3 濾光片組進(jìn)行可視化。PE-Cy5 ^?和 PE-Cy7 ^?可分別使用 Cy5 和 Cy7 濾光片組進(jìn)行可視化。

#串聯(lián)染料使用建議

避免長(cháng)時(shí)間暴露在光線(xiàn)下，串聯(lián)染料極易受到光漂白的影響，應始終避免光照

不要冷凍（-20℃）串聯(lián)結合物，這可能會(huì )導致供體變性

固定和通透步驟可能會(huì )降低串聯(lián)染料的亮度

在進(jìn)行多色流式細胞術(shù)時(shí)，使用適當的對照，如用于背景的同型對照、未染色的細胞和用于補償的單色對照

在分析數據之前確定是否需要補償，這是由于兩個(gè)或多個(gè)串聯(lián)體的發(fā)射光譜重疊。

AAT提供多種PE和PE串聯(lián)染料：

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表1.適合多色流式分析使用的PE串聯(lián)染料

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表2.適合標記CD抗體的PE和PE串聯(lián)染料可用于流式細胞術(shù) (FACS) 

ε = molar extinction coefficient at their maximum absorption wavelength最大吸收波長(cháng)處的摩爾消光系數(Units = cm-1M-1).

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表3.AAT獨有的PE-iFluor系列串聯(lián)染料可以完美替代PE-Cy5，PE-Cy7，PE-AF 700，PE-Texas Red

圖5.抗人CD4抗體全血細胞的流式細胞術(shù)分析(克隆:SK3)

偶聯(lián)物：CD4-XX780(流式抗體供應商A)，CD4-PE-Cy7(流式抗體供應商B)，CD4-PE-iFluor750(AAT)

AAT Bioquest 的高性能產(chǎn)品使科研人員能夠更好地了解生物化學(xué)、免疫學(xué)、細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)。產(chǎn)品主要分為五類(lèi)：

①反應性熒光和發(fā)光探針、生物素和標記酶，用于標記小藥物分子和生物聚合物，例如蛋白質(zhì)、核酸和碳水化合物

②用于檢測蛋白質(zhì)、核酸和活細胞的熒光和發(fā)光探針

③用于檢測各種酶（特別是水解酶和氧化還原酶）的熒光和發(fā)光探針

④為信號轉導研究而開(kāi)發(fā)和改進(jìn)的試劑

⑤生理和神經(jīng)探針，如鈣指示劑和膜電位探針